Home » Влияние компонентов ивермектина на выживаемость комаров Anopheles dirus и Anopheles minimus | Паразиты и переносчики

Влияние компонентов ивермектина на выживаемость комаров Anopheles dirus и Anopheles minimus | Паразиты и переносчики

Комары

Комары для экспериментов были выращены в исследовательском отделе инсектицидов кафедры медицинской энтомологии факультета тропической медицины Университета Махидол в Бангкоке, Таиланд. Комаров Anopheles dirus (штамм Kaw Mai Khaw) выращивали, как описано ранее. [16], с небольшими изменениями условий выращивания: 28 ± 2 °C, относительная влажность 80 ± 10% и световой/темновой световой период 12/12 часов. Личинки Anopheles dirus выращивались при плотности 200 особей на лоток (28 × 35 × 5 см) с пищевым порошком для рыб (Optimum; Perfect Companion Group Co., Ltd., Бангкок, Таиланд), который давался ежедневно в количестве 0,01–0,04 г. на лоток в первом и втором возрастах и ​​0,05–0,06 г на лоток в третьем и четвертом возрастах. Комаров Anopheles minimus (штамм Сарабури) выращивали аналогичным образом, с незначительной модификацией при выращивании личинок: суточное количество пищевого порошка для рыб, обеспечиваемого 200 личинками на лоток, составляло 0,01–0,02 г в течение первого и второго возрастов и 0,03–0,03– 0,04 г на лоток для третьего и четвертого возрастов. Куколки были пересажены в пластиковые стаканчики и помещены в клетку (30×30×30 см). Взрослым комарам давали вату, пропитанную 5% раствором сахара (Lin, Thai Roong Ruang Sugar Group Co., Ltd., Пхетчабун, Таиланд), смешанным с 5% раствором поливитаминного сиропа (Seven Seas, PT; Merck Tbk., Джакарта, Индонезия); вату меняли раз в неделю.

Личинки комаров, использованные в экспериментах, выращивали описанным выше способом. Куколок, использованных для экспериментов, переносили в пластиковые цилиндры (диаметр 16×16,5 см, диаметр×высота), наполненные 60 мл воды и закупоренные сетчатым экраном. Взрослым комарам давали 5% раствор сахара, смешанный с 5% раствором поливитаминного сиропа, в течение первых 48 часов после вылета, а затем 10% раствор сахарозы ad libitum до начала экспериментов. Комары для экспериментов находились в возрасте 5–7 дней после вылупления на момент кормления кровью. Комаров осторожно переносили посредством аспирации в цилиндрические картонные контейнеры емкостью 0,5 л, запечатанные сетчатой ​​сеткой сверху, причем каждый контейнер содержал 40 комаров. Комаров содержали в вертикальном инкубаторе при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности 80 ± 10% при фотопериоде свет/темнота 12/12 часов. Комары испытывали недостаток сахара, но имели доступ к воде за 16–20 часов до приема крови.

Read more:  Британские кредиторы испытывают запрет на новые ипотечные кредиты для туристических мест | Ипотека

Соединения

Рацемический ивермектин был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Порошок ивермектина B1a (чистота 95,0%) был получен от Toronto Research Chemicals (Торонто, Онтарио, Канада). Порошок ивермектина B1b (чистота 99,27%) был получен от ClearSynth Labs (Мумбаи, Индия). Таблетки ивермектина 6 мг (Вермектин®) были получены от Atlantic Laboratories Corp., LTD (Бангкок, Таиланд).

Приготовление муки из крови комаров

Все соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 2 мг/мл и растворы замораживали при температуре -20 °С до экспериментов по кормлению комаров. Цельную кровь собирали у здоровых добровольцев в пробирки с гепарином натрия в день каждого кормления мембраны комара. Замороженные маточные растворы соединений оттаивали и проводили серийные разведения в плазме человека AB+, используя стеклянно-янтарные флаконы. Конечный исходный раствор плазмы (10 мкл) смешивали с пустой цельной кровью (990 мкл) для достижения конечной концентрации, необходимой для анализа питания мембраны комаров. Для экспериментов с Ан. комарам скармливали соединения ивермектина в концентрациях от 2 до 30 нМ; для. minimus, концентрации варьировали от 0,25 до 4 нМ. Все образцы крови, приготовленные для кормления комаров, содержали <1% органических растворителей. Были приготовлены контрольные блюда с кровью; они состояли из замороженного ДМСО без соединений ивермектина, разбавленного в плазме, чтобы соответствовать максимальному соотношению ДМСО:кровь в порциях крови, содержащих соединения.

Анализы питания и смертности мембран комаров

При каждом кормлении мембраны комара группам по 40 An давали цельную кровь, смешанную с различными соединениями в диапазоне концентраций. dirus и 40 Ан. minimus через мембранные кормушки нагревались до 37°С. Комарам давали возможность питаться через мембрану в течение 30 минут. После мембранного кормления до 30 кровососущих комаров на контейнер осторожно переносили аспирацией в чистые картонные контейнеры (0,5 л) и контейнеры выдерживали в инкубаторе при температуре 25 ± 1 °С и влажности 80 ± 10 % с температурой 12/12. -h светлый/темный фотопериод. Комарам давали 10% сахарозы без ограничений. Выживаемость комаров контролировали ежедневно в течение 10 дней после кормления кровью, а всех мертвых комаров удаляли аспирацией и записывали. Через десять дней после приема крови все оставшиеся комары были признаны живыми, а затем заморожены.

Измерения ивермектина B1a и B1b методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.

Рацемический ивермектин растворяли в смеси метанол:вода в соотношении 50:50 до конечной концентрации 1 мг/мл, а затем разбавляли в 10000 раз в смеси ацетонитрил:вода в соотношении 40:60. Образец разбавленного раствора ивермектина (100 нг/мл) объемом 5 мкл вводили в систему жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Таблетку ивермектина измельчали ​​в ступке и 1 мг порошка растворяли в смеси метанол:вода в соотношении 50:50 до конечной концентрации 1 мг/мл. Смесь измельченных таблеток разбавляли в 10000 раз смесью ацетонитрил:вода (40:60) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин. Образец разведенного ивермектина объемом 5 мкл (100 нг/мл) вводили в систему ЖХ-МС. Ивермектин B1a и B1b из таблетки и порошка рацемического ивермектина измеряли для определения соотношений B1a и B1b.

Read more:  Стокгольм, столицу Швеции, захлестнули бандитские разборки / Статья

В качестве системы ЖХ-МС использовалась система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (четвертичный насос Agilent 1260, высокопроизводительный автосамплер Agilent 1260 и термостатический отсек для колонки Agilent 1290 SL; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), соединенная с квадруполем. времяпролетный масс-спектрометр (Q-TOF-MS) (TripleTOF 5600+; Sciex, Фрамингем, Массачусетс, США) с ионизацией электрораспылением (ESI) с использованием источника ионов DuoSpray. Подвижная фаза ВЭЖХ представляла собой воду, содержащую 10 мМ ацетата аммония и 0,1% муравьиной кислоты (подвижная фаза А) и ацетонитрил:вода в соотношении 95:5 (по объему), содержащую 10 мМ ацетата аммония и 0,1% муравьиной кислоты (подвижная фаза В). ). Виалы LC во время анализа хранились в автосамплере при температуре 6 °C. Смеси образцов вводили в обращенно-фазовую колонку C18 (Acquity UPLC HSS T3, 2,1 × 100 мм, 1,8 мкм; Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США), защищенную предварительной колонкой (Acquity UPLC HSS T3, 2,1 × 5 мм, 1,8 мкм; Waters Corp.) для разделения при скорости потока 0,3 мл/мин при 40°С. Градиент элюирования ВЭЖХ начинался с 40% подвижной фазы B в течение 2,0 мин (0–2,0 мин), затем следовали 40–80% B в течение 2,0 мин (2,0–4,0 мин), 80–100% B в течение 5,0 мин (4,0–9,0 мин). мин), 100 % Б – 5,0 мин (9,0–14,0 мин), 100–40 % Б – 0,1 мин (14,0–14,1) и 40 % Б – 3,9 мин (14,1–18,0 мин). Система ВЭЖХ-Q-TOF-MS, масс-ионная хроматограмма и масс-спектры были получены с помощью программного обеспечения Analyst™ версии 1.7 (Sciex). Q-TOF-MS работал в положительном режиме ESI, газы-источники ионов 1 и 2 при давлении 40 фунтов на квадратный дюйм каждый, газовая завеса при 30 фунтов на квадратный дюйм, напряжение ионного распыления при 4500 В, температура источника при 350 °C и потенциал декластеризации при 120 фунтах на квадратный дюйм. V. Данные были получены в информационно-зависимом режиме сбора данных, состоящем из сканирования TOF-MS и 10 зависимых сканирований продуктов ионов в режиме высокой чувствительности с динамическим вычитанием фона. Массовый диапазон сканирования TOF-MS составлял m/z 100–1000, а сканирования дочерних ионов — m/z 50–1000. Количественное определение уровня ивермектина B1a и B1b проводили с помощью программного обеспечения MultiQuant™ (Sciex) в режиме сканирования TOF-MS с высоким разрешением.

Read more:  Тело израильского солдата также взорвалось после того, как он ударил ногой палестинский флагшток, оборудованный минами-ловушками.

Статистический анализ

Летальные концентрации, от которых погибают 50% и 90% комаров (LC50 и LC90 соответственно), были оценены с использованием нормализованного анализа концентрации и реакции с четырьмя переменными (IC50 [half-maximal inhibitory concentration]Холм [Hill-Slope]ЭМИН [point of minimum mortality]и ЕМАКС [point of maximum mortality]). Все параметры оценивались по данным наблюдений, за исключением EMAX, значение которого предполагалось достигающим 100% при бесконечных концентрациях. 95% доверительные интервалы (95% ДИ) вокруг точечных оценок были получены с использованием симметричного (асимптотического) приближения. Все анализы выживаемости комаров проводились с помощью GraphPad Prism v.10.2 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).

2024-05-15 19:54:42


1715804717
#Влияние #компонентов #ивермектина #на #выживаемость #комаров #Anopheles #dirus #Anopheles #minimus #Паразиты #переносчики

Leave a Comment

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.