Лаборатория разработала модель клеток легких человека A549, подходящую для исследования противовирусных препаратов против SARS-CoV-2

В исследовании, недавно опубликованном на биоRxiv* сервер препринтов, исследователи разработали модель на основе эпителиальных клеток легких человека A549 для исследования репликации коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), чтобы облегчить открытие противовирусных препаратов против SARS-CoV-2.

Учиться: Модельная система клеточной культуры, использующая сконструированные клетки A549 для экспрессии высоких уровней ACE2 и TMPRSS2 для исследования инфекции SARS-CoV-2 и противовирусных препаратов. Изображение предоставлено: Microgen/Shutterstock.com

Крайне необходимо найти эффективные противовирусные препараты против SARS-CoV-2, которые могли бы дополнить текущую стратегию вакцинации для борьбы с продолжающейся пандемией, вызванной этим вирусом. Чтобы удовлетворить эту потребность, настоящее исследование было сосредоточено на модели на основе линии клеток легких человека, которая могла бы воспроизводить жизненный цикл SARS-CoV-2, способствовать изучению взаимодействия вирус-хозяин и способствовать открытию новых противовирусных препаратов.

Об исследовании

SARS-CoV-2 использует ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) в клетках-хозяевах в качестве рецептора для проникновения и трансмембранную протеазу серин 2 (TMPRSS2) для примирования белка шипа (S). Исследователи настоящего исследования последовательно трансдуцировали лентивирусные гены ACE2 и TMPRSS2 в клетки A549. После отбора пуромицином они протестировали более 50 клонов на вирусную инфекцию SARS-CoV-2.

Родительский клон 43.20 демонстрировал низкие уровни экспрессии ACE2, но проявлял уровень инфекционности около 20%. В результате исследователи выбрали этот клон для дальнейшего обогащения рецептора ACE2 путем сортировки клеток. С этой целью отсортированная клеточная популяция, демонстрирующая высокий уровень экспрессии ACE2, была названа ACE2plus, которая также допускала репликацию SARS-CoV-2.

Команда провела сравнительное заражение изолятом WA1/2020 и рекомбинантным вирусом (icSARS-CoV-2mNG) в клетках ACE2plus и Vero E6. Инфицированные клетки ACE2plus дикого типа демонстрировали уровень инфицирования около 60%, в то время как клетки Vero E6 показали уровень инфицирования около 70%.

Создание высокоразрешающей клеточной модели ACE2plus для репликации SARS-CoV-2. (A) Экспериментальная схема для установки A5494320 и A549ACE2/TMPRSS2 (ACE2plus). Инфекция SARS-CoV-2 наблюдалась в клетках ACE2plus (B) и 43.20 (C) через 48 часов после заражения. Спайк-специфическое антитело использовали для обнаружения инфицированных клеток; 96-луночные планшеты визуализировали с помощью ImageXpress, 4-кратное увеличение, масштабная линейка 100 мкм. (D) Отсканированные изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения MetaXpress для определения инфекционности (клетки Spike+ были нормализованы к общему количеству клеток). В условиях 1 20 000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет; 15 000 клеток были высеяны в условиях 2. (E) ACE2plus демонстрирует сопоставимую инфекционность с клетками Vero E6 при заражении SARS-CoV-2 (WA1/2020) или icSARS-CoV2-mNG (WA1/2020). (F, G) Вируссодержащие супернатанты из инфицированных клеток ACE2plus через 48 часов после инфицирования собирали и анализировали с помощью RT-qPCR и анализа бляшек для измерения вирусной нагрузки и вирусных частиц, их способности образовывать бляшки. Данные представляют собой среднее (±SD) из двух независимых экспериментов.

Уровни вирусного нуклеопротеина рибонуклеиновой кислоты (РНК) определяли количественно с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR) в режиме реального времени, для которой супернатанты собирали из клеток, обработанных вирусом дикого типа и icSARS-CoV-2-mNG в 48 часов после заражения (pi) и обработаны для выделения РНК.

Слияние клеток позволяет вирусам заражать соседние клетки, для чего требуется многоосновной сайт S1/S2 S SARS-CoV-2, который также включает образование синцития. Размер синцитиев является отличительной чертой патологии, связанной с коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19); таким образом, может быть важно понять способность образования синцития между шиповидными вариантами SARS-CoV-2.

Для этого исследователи сначала создали стабильную клеточную линию mCherry, используя модель ACE2plusC3. После сортировки более 98% клеток экспрессировали белок mCherry; поэтому эту клеточную модель использовали для наблюдения за кинетикой S-опосредованного слияния клеток без совместного культивирования с другими клетками. Затем они трансфицировали равное количество указанных S-плазмид в клетки ACE2plusC3-mCherry в течение 24 часов.

Исследователи также оценили эффективность мезилата камостата, EIDD-1931 и ремдесивира в ингибировании инфекции SARS-CoV-2. Затем они исследовали эффективность ингибитора фурина Decanoyl RVKR-CMK, чтобы определить потребность в фуриновой протеазе для образования синцития в клетках ACE2plucC3.. Клетки инфицировали изолятом WA1/2020 при MOI 0,1, инокулировали различными концентрациями Decanoyl-RVKR-CMK в течение 36 часов.

Опосредованное SARS-CoV-2-Spike образование синцития в клетках ACE2plusC3. (A) Экспериментальная схема для наблюдения за образованием синцития. Чтобы визуализировать и захватить изображения всей лунки, был отсканирован весь 24-луночный планшет (B) Репрезентативные изображения из двух независимых экспериментов. Плазмиды SARS-CoV-2 Spike трансфицировали в клетки с обработкой ингибитором протеазы или без нее. Через 24 часа клетки фиксировали и сканировали с помощью цитометра Celigo Image. Образы mCherry и DAPI были объединены компанией Celigo Software. Масштабная линейка 100 мкм. Звездочкой показана область синцития.

Результаты исследования

Даже при низкой множественности заражения (MOI) 0,05 и 0,1 клетки ACE2plus показали более высокую инфекционность, чем родительские клетки 43,20. MOI относится к количеству вирионов, добавленных на клетку во время инфекции.

По сравнению с клетками ACE2plus клетки Vero E6 показали в 1,75 раза более высокую инфекционность при обработке вирусом дикого типа и примерно в 1,2 раза более высокую инфекционность при обработке icSARS-CoV-2-mNG. В целом результаты исследования показали сопоставимую эффективность клеток ACE2plus и Vero E6 для моделирования инфекций SARS-CoV-2.

Результаты исследования также показали, что субклон ACE2plusC3, полученный из одной клетки, был очень восприимчив к инфекции SARS-CoV-2 и демонстрировал более высокие уровни экспрессии матричной РНК (мРНК) ACE2 и TMPRSS2, чем коммерчески используемые клетки Calu3. Кроме того, рецепторы ACE2 на поверхности клеток ACE2plusC3 были распознаны белком рецептор-связывающего домена SARS-CoV-2 (RBD), что подтверждает использование ACE2plusC3 для анализов лентивирусной инфекции SARS-CoV-2 257.

Камостат мезилат, EIDD-1931 и ремдесивир проявляли сильное противовирусное действие при полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) 59,98 мкМ, 0,84 мкМ и 0,14 мкМ соответственно. Эти результаты демонстрируют, что клеточную модель ACE2plucC3 можно использовать для оценки противовирусных препаратов.

Многоядерный синцитий является распространенным клиническим признаком тяжелого COVID-19, индуцированного в клетках ACE2plusC3 либо вирусной инфекцией, либо сверхэкспрессией спайковых белков вариантов SARS-CoV-2. Дельта- и бета-вариантные шиповидные белки SARS-CoV-2 индуцировали образование гигантских синцитиев размером более 300 микромоль из многоядерных увеличенных клеток по сравнению с WA1/2020 или альфа-S.

Образование синцитиев снижалось при добавлении к трансфицированным клеткам ингибитора фуриновой протеазы, деканоил-RVKR-CMK или ингибиторов камостата. Кроме того, шиповидный белок варианта SARS-CoV-2 Omicron плохо индуцировал слияние клеток в клетках ACE2plus mCherry, что указывает на то, что модель ACE2plusC2 можно использовать для изучения S-опосредованного слияния клеток.

Выводы

В настоящем исследовании представлены данные о продукции SARS-CoV-2, псевдотипированной инфекции, спайко-опосредованном слиянии клеток с клетками и противовирусных тестах, чтобы подчеркнуть важность клеточной модели легких человека для изучения SARS-CoV-2 и его постоянно возникающие варианты.

В частности, клеточная модель A549ACE2PlusC3 появилась как альтернативная и улучшенная модель для в пробирке моделирование заболеваний, которое полезно для разработки лекарств от COVID-19 и исследований взаимодействия хозяина и вируса. В целом исследование показало надежную клеточную модель, основанную на клетках легких человека, которая может стать ценным ресурсом для исследовательского сообщества, изучающего SARS-CoV-2.

*Важное замечание

биоRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.

.

Leave a Comment

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.