Животные
Самок мышей BALB/c в возрасте 3 месяцев приобретали в лаборатории Джексона. Самок мышей BALB/c в возрасте 11 месяцев приобретали у Taconic Biosciences и использовали в экспериментах на старых мышах. Мышей содержали в особых условиях отсутствия патогенов в Бостонской детской больнице. Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и проводились под контролем Департамента ресурсов животных Детской больницы (номер протокола 19-02-3897 R). В Медицинской школе Университета Мэриленда мышей поместили в учреждение с уровнем биобезопасности 3 для инфекций SARS-CoV-2 со всеми процедурами, одобренными IACUC (протокол № 1120004).
Иммунизация
Мышам вводили мРНК-вакцину BNT162b2 SARS-CoV-2 (Pfizer-BioNTech). Суспензию BNT162b2 (100 мкг мРНК/мл) разводили 1:5 в фосфатно-солевом буфере (PBS) и 50 мкл (1 мкг) вводили внутримышечно в каудальную часть бедра. BNT162b2 был получен в виде остаточного переполнения в использованных флаконах из вакцинной клиники Бостонской детской больницы с использованием только материала, который в противном случае был бы выброшен, и был использован в течение 6 часов с момента восстановления. Мыши с имитацией лечения получали только PBS.
Всплеск SARS-CoV-2 дикого типа, экспрессия и очистка RBD
Полноразмерный шиповидный гликопротеин SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (M1-Q1208, GenBank MN90894) и конструкции RBD (аминокислотные остатки R319-K529, GenBank MN975262.1), оба с сайтом расщепления протеазой HRV3C, TwinStrepTag и 8XHisTag на С-конце были получены от Barney S. Graham (Центр исследования вакцин NIH) и Aaron G. Schmidt (Институт Рагона) соответственно. Эти векторы экспрессии млекопитающих использовали для трансфекции суспензионных клеток Expi293F (Thermo Fisher) с использованием полиэтиленимина (Polysciences). Клеткам давали возможность расти при 37 ° C, 8% CO.2 в течение дополнительных 5 дней до сбора урожая для очистки. Белок очищали в буфере PBS (рН 7,4) из отфильтрованных супернатантов с использованием либо смолы StrepTactin (IBA), либо смолы Cobalt-TALON (Takara). Аффинные метки отщепляли от элюированных образцов белков с помощью протеазы HRV 3C, а белки с удаленными метками дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superose 6 10/300 (Cytiva) для полноразмерного Spike и колонки Superdex 75 10/300 увеличения. (Cytiva) для домена RBD в буфере PBS (pH 7,4).
ИФА
Концентрации антител, специфичных для белка спайка, количественно определяли в образцах сыворотки с помощью ELISA путем модификации ранее описанного протокола.28. Вкратце, плоскодонные 96-луночные планшеты с высоким связыванием (Corning) покрывали шиповидным белком (25 нг на лунку) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Планшеты промывали 0,05% Tween 20/PBS и блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA)/PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы сыворотки серийно разбавляли в четыре раза от 1:100 до 1:1,05×10.8 и затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) антимышиными IgG, IgG1 и IgG2a (SouthernBiotech). Планшеты промывали пять раз и проявляли тетраметилбензидином (раствор субстрата BD OptEIA, BD Biosciences) в течение 5 минут, а затем останавливали добавлением 2 NH.2ТАК4. Оптическую плотность (ОП) определяли при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов SpectraMax iD3 (Molecular Devices). Титры конечной точки рассчитывали как разведение, при котором ОП превышала фон в 3 раза. Произвольное значение 50 было присвоено образцам со значениями ОП ниже предела обнаружения, для которых не было возможности интерполировать титр.
Анализ ингибирования hACE2-RBD
В анализе ингибирования hACE2-RBD использовалась модификация ранее опубликованного протокола.29. Вкратце, плоскодонные 96-луночные планшеты с высоким связыванием (Corning) покрывали рекомбинантным hACE2 (100 нг на лунку) (Sigma-Aldrich) в PBS, инкубировали в течение ночи при 4 °C, трижды промывали 0,05% Tween 20 PBS. и блокировали 1% BSA PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы сыворотки разбавляли 1:160, предварительно инкубировали с 3 нг RBD-Fc дикого типа в 1% BSA PBS в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем переносили на планшет, покрытый hACE2. В качестве положительного контроля добавляли RBD-Fc без предварительной инкубации с образцами сыворотки, а в качестве отрицательного контроля добавляли 1% BSA PBS без предварительной инкубации сыворотки. Планшеты затем трижды промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным анти-человеческим IgG Fc (SouthernBiotech) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали пять раз и проявляли тетраметилбензидином (раствор субстрата BD OptEIA, BD Biosciences) в течение 5 минут, а затем останавливали добавлением 2 NH.2ТАК4. OD считывали при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов SpectraMax iD3 (Molecular Devices). Процентное ингибирование связывания RBD с hACE2 рассчитывали как: ингибирование (%) =[1 − (Sample OD value − Negative Control OD value)/(Positive Control OD value − Negative Control OD value)]× 100.
Анализ нейтрализации псевдовирусов
Псевдовирусы SARS-CoV-2, экспрессирующие репортерный ген люциферазы, были созданы с использованием подхода, аналогичного описанному ранее.30,31. Вкратце, упаковочную плазмиду psPAX2 (AIDS Resource and Reagent Program), репортерную плазмиду люциферазы pLenti-CMV Puro-Luc (Addgene) и спайковый белок, экспрессирующий варианты pcDNA3.1-SARS CoV-2 SΔCT, совместно трансфицировали в клетки HEK293T с помощью липофектамин 2000 (ТермоФишер). Псевдовирусы вариантов SARS-CoV-2 были созданы с использованием штамма WA1/2020 (Wuhan/WIV04/2019, идентификатор доступа GISAID: EPI_ISL_402124), B.1.617.2 (Delta, идентификатор доступа GISAID: EPI_ISL_2020950) или B.1.1. 529 (Омикрон, GISAID ID: EPI_ISL_7358094.2). Через 48 ч после трансфекции собирали супернатанты, содержащие вирусы псевдотипа, которые очищали центрифугированием и фильтрованием через фильтр 0,45 мкм. Для определения нейтрализующей активности образцов сыворотки клетки HEK293T-hACE2 высевали в 96-луночные планшеты для тканевых культур с плотностью 2 × 104 клеток/лунку в течение ночи. Готовили трехкратные серийные разведения образцов сыворотки, инактивированной нагреванием, и смешивали с 50 мкл псевдовируса. Смесь инкубировали при 37°C в течение 1 часа перед добавлением к клеткам HEK293T-hACE2. Через 48 часов клетки лизировали в Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Титры нейтрализации SARS-CoV-2 определяли как разведение образца, при котором наблюдалось 50% снижение относительной световой единицы (RLU) по сравнению со средним значением контрольных лунок с вирусом.
Рестимуляция спленоцитов, окрашивание внутриклеточных цитокинов и проточная цитометрия
Селезенки мышей механически диссоциировали и фильтровали через сито для клеток 70 мкм. После центрифугирования клетки обрабатывали 1 мл буфера для лизиса хлорида аммония и калия в течение 2 мин при комнатной температуре. Клетки промывали и высевали в 96-луночный планшет с U-образным дном (2 × 106/лунка) и инкубировали в течение ночи в RPMI 1640 с добавлением 10% термоинактивированной FBS, пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мг/мл), 2-меркаптоэтанола (55 мМ), заменимых аминокислот (60 мМ ), HEPES (11 мМ) и L-глутамин (800 мМ) (все Gibco). На следующий день добавляли пулы шиповидных пептидов (JPT) SARS-CoV-2 дикого типа (PM-WCPV-S-1) или Omicron (PM-SARS2-SMUT08-1) в концентрации 0,6 нмоль/мл в присутствии антимышиного CD28. /49d (1 мкг/мл, BD) и брефельдин А (5 мкг/мл, BioLegend). После 6-часовой стимуляции клетки дважды промывали и обрабатывали Mouse Fc Block (BD) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки промывали и окрашивали красителем Aqua Live/Dead (Life Technologies, 1:500) в течение 15 мин при комнатной температуре. После двух дополнительных промывок клетки инкубировали со следующими антителами в течение 30 мин при 4 °C: анти-мышиный CD44. [IM7, PerCP-Cy5.5, BioLegend #103032, 1:160]анти-мышиный CD3 [17A2, Brilliant Violet 785, BioLegend #100232, 1:40]анти-мышиный CD4 [RM4-5, APC/Fire 750, BioLegend 100568, 1:160] и анти-мышиный CD8 [53-6.7, Brilliant UltraViolet 395, BD #563786, 1:80]. Затем клетки фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора BD Cytofix/Cytoperm в соответствии с инструкциями производителя и подвергали внутриклеточному окрашиванию (30 мин при 4 °C) с использованием следующих антител: антимышиный IFNγ [XMG1.2, Alexa Fluor 488, BioLegend #505813, 1:160]против мышиного ФНО [MP6-XT22, PE Cy7, BioLegend # 506324, 1:160]антимышиный ИЛ-2 [JES6-5H4, PE, BioLegend # 503808, 1:40]. Наконец, клетки фиксировали в 1% параформальдегиде (Electron Microscopy Sciences) в течение 20 минут при 4 °C и хранили в PBS при 4 °C до приобретения. Образцы анализировали на проточном цитометре LSR II (BD) и FlowJo v10.8.1 (FlowJo LLC).
Исследование заражения SARS-CoV-2 Omicron
Мышей анестезировали внутрибрюшинно 50 мкл кетамина (1,3 мг/мышь) и ксилазина (0,38 мг/мышь), разведенных в PBS. Затем мышам интраназально вводили 1×105 БОЕ SARS-CoV-2 Omicron (BA.1), любезно предоставленный доктором Мехулом Сутхаром, в 50 мкл PBS, разделенных между ноздрями. Зараженных мышей взвешивали ежедневно. На 2-й день после заражения мышей подвергали эвтаназии и собирали легкие для гистологии, анализа ответов хозяина с помощью количественной ПЦР и определения титра вируса с помощью анализа бляшек.
Анализ бляшек SARS-CoV-2
За день до заражения 2,5e5 клеток VeroTMPRSS2 высевали на лунку в 12-луночный планшет в 1 мл среды VeroTMPRSS2. [DMEM (Quality Biological), 10% FBS (Gibco), 1% Penicillin-Streptomycin (Gemini Bio Products), and 1% L-Glutamine (Gibco)]. Образцы тканей размораживали и гомогенизировали с помощью шариков размером 1 мм в Bead ruptor (Omni International Inc.), а затем центрифугировали при 21000 g в течение 2 мин. Кривая разведения с 6 точками была получена путем последовательного разбавления 25 мкл образца 1:10 в 225 мкл DMEM. Затем к клеткам добавляли по 200 мкл каждого разведения и планшеты встряхивали каждые 15 мин в течение 1 ч при 37°С. Через 1 ч в каждую лунку добавляли по 2 мл полутвердого слоя агарозы. [DMEM, 4% FBS, and 0.06% UltraPure agarose (Invitrogen)]. Через 72 часа при 37 °C и 5% CO2планшеты фиксировали в 2% PFA в течение 20 мин, окрашивали 0,5 мл 0,05% кристаллического фиолетового и 20% EtOH и дважды промывали H2О до подсчета бляшек. Затем рассчитывали титр. Для гомогенатов тканей этот титр умножали на 40, исходя из того, что средняя масса образца ткани составляла 25 мг.
Анализ экспрессии генов с помощью количественной ПЦР
РНК выделяли из образцов реагента TRI с использованием экстракции фенол-хлороформом или систем экстракции на основе колонки (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и чистоту РНК (соотношения 260/280 и 260/230) измеряли с помощью NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Образцы с соотношением А260/А280 <1,7 были исключены из дальнейшего анализа. кДНК получали из очищенной РНК с помощью RT2 Комплект для первой нити согласно инструкции производителя (Qiagen). кДНК количественно определяли с помощью количественной ПЦР на системе ПЦР в реальном времени 7300 (Applied Biosystems) с использованием предварительно разработанных праймеров SYBR Green (QIAGEN), специфичных для Fit2 (ППМ05993А), Rsad2 (PPM26539A) и Rpl13a (PPM03694A).
Статистика и воспроизводимость
Эксперименты на мышах были направлены на то, чтобы включить в общей сложности 20 мышей в группу, и проводились в виде отдельных экспериментов. Размер выборки и возрастные критерии были выбраны эмпирически на основе результатов предыдущих исследований. Мышей случайным образом распределяли по разным группам лечения. Выбросы данных не были исключены. Статистический анализ проводили с использованием Prism v9.0.2 (программное обеспечение GraphPad). Двухвостый п значения <0,05 считались значимыми. Нормально распределенные данные анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой на множественные сравнения. Данные с ненормальным распределением были логарифмически преобразованы и проанализированы с помощью ANOVA или проанализированы с помощью теста Крускала-Уоллиса, скорректированного для множественных сравнений.
Сводка отчетов
Дополнительную информацию о дизайне исследования можно найти в сводке отчета об исследованиях в области природы, связанной с этой статьей.
