Newswise — ХЬЮСТОН — (24 октября 2022 г.) — Лаборатория Университета Райса возглавляет усилия по выявлению потенциальных угроз эффективности и безопасности методов лечения, основанных на CRISPR-Cas9, Нобелевский лауреат метод редактирования генов, даже если кажется, что он работает по плану.
Биоинженер Ган Бао Райс Инженерная школа Джорджа Р. Брауна и его команда отмечают в статье, опубликованной в Научные достижения что, хотя нецелевые изменения в ДНК уже давно вызывают беспокойство, невидимые изменения, которые сопровождают целевые изменения, также необходимо распознавать и количественно оценивать.
Бао отметил Бумага о биотехнологии природы 2018 г. указывает на наличие крупных делеций. «Именно тогда мы начали искать, что мы можем сделать для их количественной оценки благодаря системам CRISPR-Cas9, разработанным для лечения серповидно-клеточная анемия,” он сказал.
Бао был ярым сторонником CRISPR-Cas9 как инструмента для лечения серповидно-клеточной анемии, поиски, которая привела его и его коллег все ближе к излечению. Теперь исследователи опасаются, что большие делеции или другие необнаруженные изменения из-за редактирования генов могут сохраняться в стволовых клетках по мере их деления и дифференцировки, что будет иметь долгосрочные последствия для здоровья.
«У нас нет хорошего понимания того, почему несколько тысяч оснований ДНК в месте разреза Cas9 могут исчезнуть, а двухцепочечные разрывы ДНК все еще могут быть эффективно воссоединены», — сказал Бао. «Это первый вопрос, и у нас есть несколько гипотез. Во-вторых, каковы биологические последствия? Большие делеции (LD) могут достигать близлежащих генов и нарушать экспрессию как гена-мишени, так и близлежащих генов. Неясно, могут ли LD вызывать экспрессию укороченных белков.
«У вас также могут быть белки с неправильной укладкой или белки с дополнительным доменом из-за больших вставок», — сказал он. «Может случиться что угодно, и клетки могут умереть или иметь ненормальные функции».
Его лаборатория разработала процедуру, которая использует одномолекулярное секвенирование в реальном времени (SMRT) с двойным уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) для поиска и количественной оценки непреднамеренных LD наряду с большими вставками и локальными хромосомными перестройками, которые сопровождают небольшие вставки/делеции (INDEL) в месте разреза Cas9 на мишени.
«Для количественной оценки крупных генных модификаций нам необходимо проводить долгосрочные исследования. ПЦР, но это может вызвать артефакты во время амплификации ДНК», — сказал Бао. «Поэтому мы использовали UMI из 18 оснований в качестве своего рода штрих-кода».
«Мы добавляем их к молекулам ДНК, которые хотим амплифицировать, чтобы идентифицировать определенные Молекулы ДНК как способ уменьшить или устранить артефакты из-за ПЦР дальнего действия», — сказал он. «Мы также разработали конвейер биоинформатики для анализа данных секвенирования SMRT и количественной оценки LD и больших вставок».
Инструмент лаборатории Бао под названием LongAmp-seq (дляампликон секвенирование), точно определяет количество как малых INDEL, так и больших LD. В отличие от SMRT-seq, для которого требуется использование секвенатора с длинным считыванием, часто доступного только на основном объекте, LongAmp-seq можно выполнять с использованием секвенатора с коротким считыванием.
Чтобы протестировать стратегию, команда лаборатории под руководством выпускницы Райс Джули Паркв настоящее время доцент кафедры биоинженерии, использовал Streptococcus pyogenes Cas9 для редактирования энхансеров бета-глобина (HBB), гамма-глобина (HBG) и B-клеточной лимфомы/лейкемии 11A (BCL11A) в гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC) у пациентов с серповидно-клеточной анемией и ген PD-1 в первичных Т-клетках.
Они обнаружили, что большие делеции до нескольких тысяч оснований встречаются с высокой частотой в HSPC: до 35,4% в HBB, 14,3% в HBG и 15,2% в генах BCL11A, а также в гене PD-1 (15,2%) в генах. Т-клетки.
Поскольку две специфические направляющие РНК CRISPR, протестированные в лаборатории Бао, используются в клинических испытаниях для лечения серповидно-клеточной анемии, он сказал, что важно определить биологические последствия больших модификаций генов из-за вызванных Cas9 двухцепочечных разрывов.
Бао сказал, что команда Райс в настоящее время изучает последствия длинных удалений на матричная РНК, медиатор, который несет код для рибосом для создания белков. «Тогда мы перейдем к уровню белка», — сказал Бао. «Мы хотим знать, сохраняются ли эти большие делеции и вставки после трансплантации HSPC с отредактированным геном мышам и пациентам».
Соавторами исследования Райс являются аспиранты Мингминг Цао и Йилей Фу, выпускники Идан Пан и Тимоти Дэвис, специалист-исследователь Лаванья Саксена, специалист по микроскопии и биоинструментации Харшавардхан Дешмукх и Тодд Треанген, доцент кафедры компьютерных наук, и Вивьен из Университета Эмори. Шихан, адъюнкт-профессор педиатрии.
Бао — заведующий кафедрой и семейный профессор биоинженерии Фойт, профессор химии, материаловедения, наноинженерии и машиностроения, а также стипендиат CPRIT в области исследований рака.
Национальные институты здравоохранения (R01HL152314, OT2HL154977) поддержали исследование.
-30-
Читать аннотацию на https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo7676.
Этот пресс-релиз можно найти в Интернете по адресу https://news.rice.edu/news/2022/even-good-gene-edits-can-go-bad.
Следите за новостями о рисе и отношениями со СМИ через Twitter @RiceUNews.
Связанные материалы:
Rice lab предлагает новые стратегии, инструменты для редактирования генома: https://news2.rice.edu/2016/02/08/rice-lab-offers-new-strategies-tools-for-genome-editing-2/
Новое генетическое оружие бросает вызов серповидно-клеточной анемии: https://news2.rice.edu/2019/06/03/new-genetic-weapons-challenge-sickle-cell-disease-2/
Бао Лаборатория: http://bao.rice.edu
Департамент биоинженерии Райса: https://bioengineering.rice.edu
Инженерная школа Джорджа Р. Брауна: https://engineering.rice.edu
Университет Райса, расположенный в кампусе площадью 300 акров в Хьюстоне, неизменно входит в число 20 лучших университетов страны по версии US News & World Report. Райс имеет очень уважаемые школы архитектуры, бизнеса, непрерывного обучения, инженерии, гуманитарных наук, музыки, естественных и социальных наук, а также является домом для Института государственной политики Бейкера. С 4240 студентами и 3972 аспирантами Райс соотношение студентов бакалавриата к преподавателям составляет чуть менее 6 к 1. Его система колледжей-интернатов создает сплоченные сообщества и дружбу на всю жизнь, что является лишь одной из причин, по которой Райс занимает первое место по количеству взаимодействий между расами и классами и первое место по качеству жизни по версии Princeton Review. Райс также оценивается Kiplinger’s Personal Finance как лучший среди частных университетов.
