Криоэлектронная микроскопия раскрывает детальный план механизма репликации вирусного генома

РНК-вирусы, такие как коронавирус, вызывающий COVID-19, вступают в гонку не на жизнь, а на смерть в тот момент, когда они заражают клетку.

У этих вирусов есть всего несколько минут, чтобы установить свой механизм репликации внутри клетки-хозяина, прежде чем генетические инструкции, содержащиеся в их уязвимых геномах РНК, которые более хрупкие, чем ДНК, в противном случае будут уничтожены клеточным хозяйством. В случае успеха вирус может пройти путь от нескольких копий своего генома РНК до полумиллиона копий, включенных в новые инфекционные частицы, менее чем за 12 часов. Если нет, то вирус погибнет.

В исследовании, опубликованном в Интернете 24 января Труды Национальной академии наук (ПНАС), ученые Института исследований Моргриджа пролили новый свет на эти важные ранние стадии вирусной инфекции и контроль над ними. Исследователи разработали новые способы высвобождения комплексов репликации вирусной РНК из клеток и сложных способов их визуализации с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).

Крио-ЭМ сочетает в себе передовую визуализацию с обширным вычислительным анализом, что позволяет ученым визуализировать мгновенно замороженные молекулы в их естественном состоянии с разрешением от молекулярного до атомного, что дает революционное понимание биологической структуры, что может стать мощной основой для разработки терапевтических средств для предотвращения болезней.

Исследовательскую группу возглавляет Пол Алквист, директор Центра вирусологии Джона и Джин Роу и профессор молекулярной вирусологии и онкологии Университета Висконсин-Мэдисон. В команду входят ученые Хонг Чжан, Нуруддин Унчванивала и Йохан ден Бун, исследователь Моргриджа и доцент кафедры биохимии UW-Madison Тим Грант, а также соавторы Андреа Реболледо-Виверос, Дженис Пеннингтон, Марк Хорсвилл, Рома Бродберри и Джонатан Майерс.

Большинство генов микробов и хозяина функционируют в виде больших белковых комплексов, которые действуют как молекулярные машины. Однако структуры этих критических узлов в значительной степени были неизвестны, что сильно ограничивало понимание и контроль соответствующих процессов. В 2017 году, используя усовершенствованную модель вируса, лаборатория Альквиста предоставила первое полное изображение комплекса репликации вирусной РНК и его поразительной организации.

Они обнаружили, что родительская вирусная геномная РНК «хромосома» плотно свернута внутри защитной мембранной везикулы, шейка которой ведет к цитоплазме, как они обнаружили, как место фактического механизма репликации вирусной РНК — динамического, многофункционального механизма копирования генома — в ранее неизвестный 12-кратный симметричный кольцевой комплекс, который они назвали «короной».

Теперь в своей новой статье в ПНАС, команда делает еще один шаг вперед, раскрывая сложную структуру этой молекулярной короны и составляющих ее ферментных доменов с разрешением от атомного до почти атомарного. Эти результаты со значительно более высоким разрешением показывают, как устроены многие отдельные функциональные модули этого репликативного механизма, обеспечивая необходимую основу для разработки его сборки, его динамической работы и способов вмешательства в то и другое.

Для сравнения, первый автор Хун Чжань говорит: «Первые визуализации механизмов короны нашей лабораторией в 2017 году были похожи на определение существования и общего контура здания. Новое разрешение 2023 года похоже на отображение мелких деталей, таких как электрическая проводка и дверные замки.”

«В вирусологии, — говорит Алквист, — комплексы, на которых люди до сих пор сосредоточивались, в основном представляли собой инфекционные частицы, которые перемещаются между клетками, которые относительно легко очищать и изучать, потому что они высвобождаются из клеток».

«Однако большинство процессов репликации вирусов происходят в сложной среде внутри клеток», — добавляет он. «Это новая глава, в которой мы смогли проникнуть внутрь клеток, чтобы запечатлеть и детально отобразить еще более сложный вирусный механизм, который выполняет основные события репликации вируса».

Член группы Йохан ден Бун отмечает, что, среди прочих результатов, они обнаружили, что «корона состоит из двух сложенных стопкой 12-мерных колец огромного белка репликации вирусной РНК, многочисленные домены которого обеспечивают все функции, необходимые для синтеза новых копий вирусного генома. РНК. Однако белки в верхнем и нижнем кольцах находятся в совершенно разных конформациях, а составляющие их домены находятся в разных положениях по отношению друг к другу».

Одним из следствий этого является то, что одни и те же белковые домены действуют по-разному в верхнем и нижнем кольцах. Многочисленные другие особенности подчеркивают, что корона не является статичной структурой, а представляет собой сложную, активную машину, которая прогрессирует и циклически выполняет серию движений для выполнения своих последовательных действий. Основываясь на этой структуре и дальнейших целенаправленных экспериментах, команда Моргридж выясняет функции короны и конформационную гимнастику.

Другим ценным открытием из этих исследований является то, что нижнее 12-мерное кольцо является предшественником сборки, который формируется до фактических этапов репликации РНК. Затем этот предшественник «прото-короны» рекрутирует матрицу вирусной геномной РНК и другие компоненты, чтобы инициировать синтез новых РНК, и служит основой для сборки зрелого комплекса репликации с двойным кольцом.

Растущие данные свидетельствуют о том, что корона не только синтезирует новые копии генома вирусной РНК, но также помогает доставлять эти новые геномы в последующие процессы экспрессии генов и сборки новых инфекционных вирусных частиц. Таким образом, коронка, по-видимому, выполняет основные функции по организации многих критических фаз инфекции.

Простого замедления сборки и функционирования комплексов репликации РНК достаточно, чтобы убить эти вирусы. Эти новые результаты обеспечивают прочную основу для поиска новых способов сделать это».

Пол Алквист , директор Центра вирусологии Джона и Джин Роу и профессор молекулярной вирусологии и онкологии Университета Висконсин-Мэдисон.

Алквист и другие члены команды хвалят Исследовательский центр Cryo-EM UW-Madison (CEMRC) и его руководство как решающие для их прогресса. CEMRC делает эту ценную технологию доступной для множества ученых в кампусе Университета Вашингтона в Мэдисоне, а в качестве национального центра — далеко за его пределами. Центр CEMRC, возглавляемый профессором биохимии Элизабет Райт, предоставляет передовые возможности практически во всех формах крио-ЭМ визуализации.

Новые результаты, полученные группой Моргридж и другими исследователями, показывают, что принципы, выявленные в этих исследованиях, являются эволюционно древними, и что подобные короноподобные комплексы играют центральную роль в репликации большинства, если не всех, РНК-вирусов этого большого класса. Сюда входит коронавирус COVID-19 SARS-CoV-2 и многие другие патогены.

Соответственно, консервативные базовые принципы могут служить основой для разработки более мощных противовирусных стратегий широкого спектра действия, которые могли бы ингибировать заражение не одним, а целыми группами вирусов, говорит Алквист.