Основа жизни зависит от сложного взаимодействия информации, хранящейся в эпигеноме, геноме и клеточном механизме. Считается, что это программное и биологическое оборудование. Однако пока неизвестно, вызывает ли старение поломка программного или аппаратного обеспечения. В 1950-х Сцилард и Медавар независимо друг от друга предположили, что старение является результатом потери генетической информации, вызванной повреждением ДНК. Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) чаще всего связан со старением. Однако в последние годы предположение о том, что мутации играют важную роль в старении, было поставлено под сомнение.
Изучение: Потеря эпигенетической информации как причина старения млекопитающих Кредит изображения: picmedical / Shutterstock
Известно, что хроматиновые структуры и транскрипционные сети определяют клеточную идентичность во время развития, что направляет клетки в метафорические долины в ландшафте Уоддингтона. Клетки должны сохранять свою идентичность за счет сохранения эпигенетической информации и состояния низкой энтропии Шеннона для поддержания оптимального функционирования. Исследования дрожжей в 1990-х годах показали, что потеря эпигенетической информации по сравнению с генетикой может вызвать старение. Несколько других исследований также подтвердили, что эпигенетические изменения являются не только биомаркером, но и причиной старения дрожжей.
Эпигенетические изменения, связанные со старением, включают изменения в паттернах метилирования ДНК (DNAme), H3K27me3, H3K9me3 и H3K9me3. Было замечено, что многие эпигенетические изменения следуют определенному образцу. Однако причина изменений в эпигеноме млекопитающих пока неизвестна. Некоторые подсказки можно получить у дрожжей, где DSB является важным фактором, репарация которого требует эпигенетических регуляторов Esa1, Gcn5, Rpd3, Hst1 и Sir2. Согласно «гипотезе RCM» и «информационной теории старения», старение у эукариот происходит из-за потери эпигенетической информации и транскрипционных сетей в ответ на клеточное повреждение, такое как травма при аварии или DSB.
Новое исследование в журнале Клетка целью было определить, являются ли эпигенетические изменения причиной старения млекопитающих.
Об исследовании
В исследовании участвовала система, состоящая из слияния I-PpoI (эндонуклеаза из Физарум полицефалум) к С-концу регулируемого тамоксифеном (ТАМ) мутантного гена домена рецептора эстрогена (ERT2), регулируемого ТАМ гена рекомбиназы Cre (Cre-ERT2) выше промотора убиквитина и транскрипционной кассеты loxP-STOP-loxP. Трансгенные мыши с гетерозиготными Cre-ERT2 и ERT2-I-PpoI были названы индуцируемыми изменениями эпигенома или мышами ICE, в то время как Cre, IPpoI и дикий тип (WT) были отрицательными контролями.
Вестерн-блоттинг проводили с использованием клеток эмбриональных фибробластов мыши (MEF) и образцов тканей, тогда как саузерн-блоттинг проводили с использованием геномной ДНК. Анализ Surveyor проводили путем амплификации областей-мишеней I-PpoI из геномной ДНК с последующим метаболическим мечением MEF. После этого количественно определяли синтез белка и DSB. Коэффициент дыхательного обмена (RER), производство углекислого газа (VCO2), потребление кислорода (VO2), амбулаторную активность и потребление пищи измеряли с помощью непрямой калориметрии.
Проведена монохромная мультиплексная количественная ПЦР с последующей оценкой индекса хрупкости (ИФ). Оценку помутнения хрусталика проводили вместе с микро-КТ сканированием, количественным определением аксонов зрительного нерва, количественным определением субэпидермальной толщины, иммуногистохимией для кожи мыши и иммуногистохимией головного мозга, а также измерением мтДНК и АТФ. После этого было проведено несколько тестов, в том числе контекстуальный тест на условно-рефлекторный страх, тест с лабиринтом Барнса, тест на беговой дорожке, тест на силу захвата, а также измерение лактата и амбулаторной активности.
Измерение паттернов походки проводилось с помощью принудительной ходьбы на беговой дорожке. Капиллярную плотность, окрашивание цитохромоксидазой (ЦОГ) и электронную микроскопию проводили с использованием изолированных мышц мышей. Произошла количественная оценка плотности подоцитов с последующим анализом гломерулярного повреждения и перехода париетальных эпителиальных клеток в мезенхимальные. После этого использовали окрашивание 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU), визуализацию и микроскопию почек, иммуноцитохимию и анализ b-галактозидазы, связанной со старением (SA-b-Gal). Было выполнено перепрограммирование нейронов, управляемое малыми молекулами, с последующей количественной ПЦР в реальном времени для транскрипции повторяющихся элементов и определения частоты мутаций 28SrDNA.
Кроме того, происходила продукция и трансдукция аденоассоциированных вирусов с последующей сортировкой секвенирования РНК и ганглиозных клеток сетчатки (RGC). Также была проведена иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием ДНК (ChIP-seq), анализом Hi-C, HiChIP и полногеномным секвенированием. Кроме того, были проанализированы эпигенетические часы для фибробластов, мышц и крови. Наконец, была проведена масс-спектрометрия гистонов.
Результаты исследования
Результаты показали, что HA-I-PpoI был обнаружен в ядрах клеток ICE после добавления ТАМ, но не в контрольных клетках. Наблюдалось, что количество серин-139-фосфорилированных очагов H2AX (gH2AX), которые являются маркером DSB, достигало 4-кратного фона за 24 часа в клетках ICE. Никаких изменений в профиле клеточного цикла, старении, апоптозе, частоте мутаций, общей эффективности трансляции или уровнях РНК не наблюдалось во время и после индукции I-PpoI. Сообщалось, что клетки ICE примерно в 1,5 раза старше по сравнению с контрольными клетками Cre.
После постобработки клетки ICE были более уязвимы для агентов, повреждающих ДНК, чем контрольные. Также наблюдалось увеличение показателей клеточного старения в постобработанных клетках. Было замечено, что система ICE вызывает специфические разрезы in vivo, но не приводит к мутациям или немедленным вредным эффектам. Кроме того, через 10 месяцев после индукции I-PpoI у мышей ICE наблюдались признаки старения. Кроме того, признаки старения кожи, мозга, мышц и почек были совершенно очевидны у мышей с ICE через 10 месяцев после лечения.
Кроме того, сообщалось, что скорость эпигенетического старения примерно на 50 процентов выше, чем у контрольных мышей Cre. Более высокие количества H3K122ac, тогда как более низкие количества H3K56ac и H3K27ac наблюдались в обработанных клетках ICE. Более того, эффекты DSB на экспрессию генов факторов транскрипции гомеобокса (Hox) не зависят от места разрыва ДНК. Кроме того, DSB разрывает измененные пространственные контакты хроматина.
Сообщалось, что после обработки фибробласты ICE теряют способность сохранять свою клеточную идентичность и дифференцироваться в другие типы клеток. Области с более низким уровнем H3K27ac у мышей после лечения ICE были обогащены сигнатурами мышечной ткани, тогда как области с более высоким уровнем H3K27ac были обогащены энхансерами иммунных клеток. Наконец, факторы Яманаки Oct4, Sox2, Klf4 и Myc (OSKM) были экспрессированы для обращения возрастных изменений у мышей после лечения ICE.
Таким образом, текущее исследование демонстрирует, что DSB приводит к потере эпигенетической информации, еще больше ускоряя старение и возрастные заболевания. Однако млекопитающие, по-видимому, обладают резервной копией юношеской эпигенетической информации, которая может помочь восстановить функции старых тканей.
Ограничения
Исследование имеет определенные ограничения. Во-первых, исследование не определило, какие хроматиновые факторы были релокализованы. Во-вторых, он не включал анализ контактов хроматина in vivo. В-третьих, эпигеномный анализ не проводился на уровне отдельных клеток. В-четвертых, индукция ICE не происходила тканеспецифическим образом. В-пятых, некоторые эффекты в исследовании могут быть связаны с разрезанием локуса рДНК.
