1767199621
2025-12-31 16:25:00
В этом разделе мы описываем метод, который мы использовали для присвоения геномов каждому кластеру видов. Мы также проверяем надежность определения вида, используя три разных метода, и показываем, что они дают идентичные результаты.
Сравнение геномов бактериальных популяций часто выявляет кластеры разной длины и масштаба дивергенции.Джайн и др., 2018 г.). Но трактовка таких кластеров спорна (Коэн, 2002 г.; Фрейзер и др., 2009 г.). Есть три основные возможные интерпретации таких закономерностей. Одна из интерпретаций состоит в том, что кластеры представляют собой бактериальный аналог видов эукариот, которые сексуально и экологически изолированы друг от друга. На практике для определения вида бактерий часто используется пороговое значение дивергенции всего генома, равное 5%.Джайн и др., 2018 г.). Альтернативная интерпретация состоит в том, что кластеры являются результатом клональной экспансии определенных штаммов из гораздо более разнообразной и, возможно, более генетически более однородной популяции. Третья интерпретация заключается в том, что кластеры являются результатом неравномерной выборки из более крупной и разнообразной популяции. Уникальное сочетание наличия большой коллекции геномов с минимальной композиционной погрешностью из географически изолированной популяции позволяет нам протестировать эти альтернативы. В основном мы будем стремиться различать первые две интерпретации и третью, проверяя, есть ли в нашей выборке устойчивые геномные кластеры. Более подробное обсуждение доказательств, касающихся первых двух гипотез, можно найти в Приложениях 3 и 5.
Мы использовали три разных метода, чтобы проверить, образуют ли геномы надежные кластеры: филогенетическое дерево последовательностей 16S рРНК, среднее расхождение по всему геному от двух эталонных геномов OS-A и OS-B’ и закономерности расхождений между триплетами, образованными SAG, и двумя эталонными последовательностями в разных локусах. Филогенетическое древо 16S является самым простым и до сих пор наиболее часто используемым методом характеристики разнообразия природных микробных сообществ.Ярза и др., 2014 г.). Из-за его практической важности мы включили его для сравнения с двумя другими методами. Однако в такой сильно рекомбинирующей популяции, как Йеллоустонский Синехококкнеясно, в какой степени расхождение 16S точно отражает разнообразие всего генома. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали для сравнения различия по всему геному. Основное ограничение использования сводной статистики, такой как среднее расхождение по всему геному, заключается в том, что она скрывает неоднородности генома, которые могут иметь важные экологические и эволюционные последствия. Существуют разные способы решения этой проблемы. Здесь мы использовали расширение метода, впервые использованного в Розен и др., 2018 г.который дает грубое описание вариаций моделей разнообразия в разных локусах. Далее мы представляем результаты каждого из этих анализов.
Сначала мы построили филогенетическое дерево последовательностей 16S. Предсказанные последовательности 16S рРНК (117 из 331 отфильтрованных SAG) были извлечены и выровнены с использованием MAFFT (v7.453) (Като и Стэндли, 2013 г.). Две последовательности (SAG MA02M11_3 и MuA02C9) оказались неполными и были исключены из анализа. Остальные (115) последовательностей были иерархически кластеризованы с использованием метода средней связи (UPGMA), реализованного в Scipy. Результаты показаны в Приложение 2 — рисунок 3на цветном фоне показано отнесение видов с использованием расхождений всего генома (см. Ниже) для сравнения. Мы обнаружили идеальное соответствие между распределением всего генома и тремя крупнейшими кластерами филогенетического дерева 16S.
Среднее расхождение внутри а кластер примерно вдвое меньше, чем б (1⋅10−3 против 2⋅10−3). Однако значительная часть среднего расхождения внутри б произошло из-за двух выбросов (MuA1L16 и MusA1J8). После удаления выбросов среднее расхождение в пределах б снизилось до 1,7⋅10–3. Более тщательное исследование выравниваний показало, что оба выброса б последовательности содержали короткий сегмент из трех SNP, идентичных всем а последовательности и отличается от всех других б последовательности в позициях 1067–1072. Кроме того, MuA1L16 содержал более крупный сегмент длиной почти 200 п.н. (позиции 390–570), содержащий 10 SNP и вставку, отличающуюся от всех остальных б и были идентичны консенсусному α. Помимо этих сегментов, последовательности выбросов были типичными для б разновидность. Этот паттерн аналогичен блокам SNP, обсуждаемым в основном тексте и в Приложении 6, и, следовательно, вероятно, является результатом гибридизации между а и б.
Мы сравнили кластеры 16S рРНК с полногеномными отклонениями от двух эталонных геномов, OS-A и OS-B’. Мы сопоставили все предсказанные гены из каждого SAG со всеми кодирующими последовательностями ДНК (CDS) из каждого эталонного генома с помощью BLAST (v2.13.0+) (Альтшул и др., 1990 г.). Для каждого SAG мы рассчитали расхождение с каждым эталонным геномом (d = 1-pident/100) и вычислили среднее значение для лучших совпадений по всем генам. Результаты для всех SAG с более чем 100 попаданиями в обе ссылки показаны на рисунке. Рисунок 1А. Наблюдались три четких кластера, которые мы обозначили как а, би с. Виду каждого SAG присваивалась метка, соответствующая кластеру, к которому он принадлежал в Рисунок 5А.
Для каждого SAG мы отнесли все гены, ортологичные к OS-A и OS-B’, к одному из пяти паттернов, описанных выше. Три ряда в Приложение 2 — рисунок 1 показать типичные примеры а (Приложение 2 — рисунок 1А.), а б (Приложение 2 — рисунок 1Б.), и с (Приложение 2 — рисунок 1С.) САГ. Большинство генов в каждом ряду Приложение 2 — рисунок 1 встречаются в паттернах XA–B, XB–A и X–A–B соответственно. Это согласуется с кластерами видов, которые мы видели в средних расхождениях по всему геному ранее. Однако мы также обнаруживаем значительное меньшинство генов, образующих другие паттерны, в первую очередь XAB, представляющих гены, у которых все три последовательности находятся в основном облаке (d с SAG, тот факт, что X–A–B является доминирующим паттерном, исключает возможность того, что с представляет собой гибрид, полученный в результате смеси α и б. Такие гибриды наблюдались после недавней клональной экспансии в микробных сообществах дренажных систем кислых шахт (Тайсон и др., 2004 г.; Ло и др., 2007 г.), но, по-видимому, не встречается достаточно часто в сообществе Йеллоустона. Вместо этого оказывается, что с это отдельный вид, который отделился от двух других примерно в одно и то же время. а и б расходились друг с другом.
Использование описанной выше закономерности позволяет нам сравнивать различные SAG друг с другом и проверять надежность отнесения видов на основе средней дивергенции по всему геному. В частности, мы присвоили каждому SAG тройной отпечаток гена f=(fXA-B,fXAB,fX-A-B,fX-AB,fXB-A), представляющий долю генов с каждым паттерном (обратите внимание, что ∑ifi=1). Затем мы сравнили характерные черты каждого SAG с отнесением видов, основанным на среднем расхождении от OS-A и OS-B’ от Рисунок 1А. Мы обнаружили, что отпечатки пальцев сформировали три четких шаблона, которые точно соответствовали назначениям, основанным на среднем расхождении (Приложение 2 — рисунок 2). Мы протестировали это назначение для различных значений dM в диапазоне от 1% до 20% и обнаружили, что образцы отпечатков пальцев были устойчивыми во всем диапазоне (данные не показаны). Эти результаты показывают, что классификация на отдельные виды является надежной и последовательной для всех трех описанных методов.
Кластеры видов на уровне генов примерно совпадают с кластерами видов на уровне генома.
На рисунках показано погенное сравнение трех клеток с эталонными геномами OS-A и OS-B’. Представленные клетки являются репрезентативными для а (А; OctA1J9) и б (Б; MA02H14_2) кластеры и одна γ-ячейка (С; ОcA3L13). Каждый коровый ген с гомологами как в OS-A, так и в OS-B’ сравнивали с эталонами, и расхождения отображались в виде треугольника, длина каждой стороны которого равна расхождению между данной парой. Последовательность ячеек представлена черной точкой, а последовательности OS-A и OS-B’ представлены оранжевым треугольником вверх и синим треугольником вниз соответственно. Черный круг представляет собой радиус 10%, который был выбран в качестве порогового значения для классификации каждого гена. В разных столбцах показаны гены одного из пяти возможных паттернов, обозначенных следующим образом: XA–B (последовательность клетки менее чем на 10 % отличается от OS-A и более чем на 10 % отличается от OS-B’), XAB (все три последовательности находятся в пределах 10 % друг от друга), X–A–B (все три последовательности отличаются друг от друга более чем на 10 %), X–AB (клетка отличается от обеих более чем на 10 %). OS-A и OS-B’, но оба эталона расходятся друг от друга менее чем на 10 %) и XB-A (ячейка расходится менее чем на 10 % с OS-B’ и более чем на 10 % с OS-A).
Доля паттернов триплетов генов демонстрирует три различных кластера.
Доля генов в каждом из пяти паттернов, показанных на рис. Приложение 2 — рисунок 1 показано для каждой ячейки, соответствующей нашим критериям контроля качества (см. Приложение A). Линии представляют разные клетки и окрашены в соответствии с классификацией видов, основанной на расхождениях всего генома.
Филогенетическое дерево, построенное на основе 16S рРНК, согласуется с полногеномной классификацией видов.
Попарные расхождения между всеми последовательностями 16S, прошедшими контроль качества, рассчитывали на основе множественного выравнивания последовательностей, выполненного с использованием MAFFT (Като и Стэндли, 2013 г.). Дерево было создано с использованием алгоритма иерархической агломеративной кластеризации со средней связью (UPGMA), реализованного в SciPy (Виртанен и др., 2020 г.).
#Гибридизация #разрушает #видовые #барьеры #долгосрочной #коэволюции #популяции #цианобактерий
Читайте также
