Ранее мы определили список из 60 эпигенетических регуляторов, составляющих потенциальные гены-мишени NFE2, путем опроса данных NFE2 ChIP-seq в клетках K562. [7]. Среди них гистондеметилаза JMJD2C высоко оценивается и представляет собой привлекательную мишень из-за его пролейкемической роли в миелоидных злокачественных новообразованиях. [10]. Поэтому мы исследовали, играет ли JMJD2C роль в патофизиологии миелопролиферативных новообразований (МПН).
Гистондеметилаза JMJD2C новый ген-мишень NFE2
Чтобы подтвердить сайт связывания NFE2, идентифицированный ChIP-seq на уровне +260 п.н. JMJD2C место ([7], рис. 1А), мы провели анализ ChIP в клетках HEL. Сильное обогащение NFE2 наблюдалось вокруг участка, идентифицированного на JMJD2C локус (рис. 1А). Одновременно, jmjd2c Экспрессия мРНК была значительно повышена в костном мозге трансгенных мышей со сверхэкспрессией hNFE2 по сравнению с контрольными однопометниками дикого типа (Fig. 1B). Более того, лентивирусного введения hNFE2 в клетки CB3, линии эритроидных клеток, лишенной NFE2 из-за вирусной вставки, было достаточно, чтобы вызвать jmjd2c выражение (рис. 1C). В совокупности эти данные показывают, что JMJD2C локус связан с NFE2, и это присутствие NFE2 увеличивает экспрессию JMJD2C.
А Вверху: NFE2 ChIP-seq на JMJD2C место [7]. Внизу: ChIP PCR клеток HEL с использованием антитела против NFE2 или контроля IgG, как показано. Праймеры для ПЦР фланкируют предсказанный сайт связывания на уровне +260 п.н. или сайты отрицательного контроля на уровне +4,6 т.п.н. JMJD2C локус и локус миогенина. Б jmjd2c Экспрессия мРНК в костном мозге мышей hNFE2tg (н = 12) или контрольные однопометники (н = 9) определено с помощью RT-qPCR. Выражение нормализовано к B2м выражение. С jmjd2c Уровни мРНК в клетках CB3 после инфицирования pLeGO-iG-NFE2-wt или пустым контрольным вектором. GFP-положительные клетки сортировали и jmjd2c экспрессию измеряли, как описано на панели 1B. Д Иллюстрация JMJD2C конструкция репортерного гена. Круг указывает на предполагаемый сайт связывания NFE2 +260 п.н. относительно сайта начала транскрипции (TSS). Е Котрансфекция клеток HEK-293T с JMJD2C конструкция репортерного гена люциферазы и различные комбинации экспрессионных плазмид, кодирующих кДНК NFE2 и MafG, как показано. Ф Нарушение потенциального сайта связывания NFE2 в результате сайт-направленного мутагенеза (перечеркнутый кружок). Измененные базы выделены жирным шрифтом. Е, Ф Данные нормированы на массу JMJD2C конструкция репортерного гена, котрансфицированная только MafG, которая была принята за единицу. г Типичные вестерн-блоты, изображающие экспрессию JMJD2C в лизатах гранулоцитов PB. GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. ЧАС Денситометрический анализ вестерн-блотов JMJD2C, н = 26 пациентов с МПН и н = 9 здоровых контролей. я Экспрессия белка JMJD2C в различных подтипах MPN (ET = 5, PV = 12, PMF = 9). Дж Экспрессия белка JMJD2C в зависимости от мутационного статуса (JAK2V617F= 19, CALR = 7). С, Е, Ф Данные представлены как среднее по крайней мере трех независимых экспериментов. Б, С, Е, Ф, ЧАС–Дж *п < 0,05, **п < 0,01 по Стьюденту т тест.
Чтобы оценить, достаточно ли NFE2 для прямой трансактивации промотора JMJD2C, мы провели анализы люциферазы. Область интереса, п.н. от -2220 до +522 п.н. JMJD2C locus, клонировали в репортерный вектор люциферазы (рис. 1D) и котрансфицировали в клетки HEK-293T вместе с плазмидами, экспрессирующими кДНК NFE2 либо с ее партнером по связыванию MafG, либо без него (рис. 1E). Как и предполагалось, мы наблюдали значительное увеличение активности люциферазы только в присутствии как NFE2, так и MafG. В свою очередь, сайт-направленный мутагенез последовательности распознавания NFE2 приводил к значительному снижению интенсивности сигнала (рис. 1F). Таким образом, NFE2 связывает JMJD2Cлокус и опосредует активацию его транскрипции.
Экспрессия JMJD2C повышена у пациентов с МПН
Поскольку NFE2 сверхэкспрессирован у подавляющего большинства пациентов с МПН [1]мы исследовали, увеличивает ли повышенный NFE2 у пациентов с МПН экспрессию белка JMJD2C. Гранулоциты периферической крови пациентов с МПН и здоровых людей анализировали с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1G-J). Количественная оценка экспрессии белка JMJD2C из н= 26 пациентов с МПН и н= 9 здоровых контролей (HC) выявили значительно повышенные уровни белка JMJD2C у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией, истинной полицитемией и первичным миелофиброзом (рис. 1H, I). Так же, JMJD2CУровни мРНК были значительно повышены у пациентов с ОМЛ после MPN (дополнительная рис. S1). Существенной разницы между JAK2 не наблюдалось.V617F – и пациенты с мутацией CALR (рис. 1J). Более того, экспрессия мРНК NFE2и JMJD2Cзначительно коррелируют (дополнительная рис. S2), подчеркивая возможную роль этой гистондеметилазы в патофизиологии MPN.
JMJD2C необходим для выживания JAK2.V617F мутированные клетки
Поскольку было показано, что дефицит JMJD2C ослабляет лейкемогенность при ОМЛ (обзор в Staehle et al., 2021), мы предположили, что JMJD2C избирательно влияет на пролиферацию JAK2.V617Fклетки. Следовательно, мы определили эффект нормализации повышенных уровней JMJD2C в JAK2.V617F -позитивные клетки с помощью РНК-интерференции. Наиболее эффективная кшРНК, конструкция № 3 (рис. 2А), была выбрана в клетках UKE1, что привело к снижению экспрессии JMJD2C примерно на 80–90%, как определено как RT-qPCR, так и вестерн-блоттингом (рис. 2B, C). Истощение JMJD2C сильно увеличивало глобальные уровни его целевых гистоновых меток H3K9me3, H3K27me3 и H3K36me3 (Fig. 2D-F).
А Клетки UKE1 трансдуцировали лентивирусами векторами, несущими кшРНК против JMJD2C(sh-2C #1–3) или зашифрованное управление (scr). Клетки собирали на 5-й день для выделения РНК и последующего анализа с помощью RT-qPCR. Б, С Проверка sh-2C #3 в клетках UKE1, SET2 и HEL с помощью RT-qPCR (Б) и вестерн-блоттинг (С) с использованием антитела против JMJD2C, актин служил в качестве контроля нагрузки. Д–Ф Вестерн-блоттинг истощенных по JMJD2C клеток или клеток дикого типа UKE1, SET2 и HEL с антителами против H3K9me3 (Д), H3K27me3 (Е) и H3K36me3(Ф). Гистон H3 служил контролем загрузки. г–я Пролиферация UKE1 (г), КОМПЛЕКТ2 (ЧАС) и ХЭЛ (я) клеток после введения JMJD2C-shRNA (sh-2C) или скремблированного (scr) контроля. Для каждого условия 0,25 миллиона клеток высевали и инфицировали в 1-й день. Клетки подсчитывали каждый второй день и использовали для окончательного анализа на 9-й день. Дж–л Обнаружение апоптотических (AnnexinV+/PI-) и некротических (AnnexinV+/PI+) клеток на 9-й день с помощью анализа FACS в UKE1 (Дж), КОМПЛЕКТ2 (К) и ХЭЛ (л) клетки. М–О Анализ клеточного цикла: обнаружение клеток в фазах G1 (низкий уровень DAPI), S (средний уровень DAPI) и G2/M (высокий уровень DAPI) на 9-й день с помощью анализа FACS в UKE1 (М), КОМПЛЕКТ2 (Н) и ХЭЛ (О) клетки. п–р Конкурентный рост кшРНК (sh-2C или scr), инфицированный UKE1 (п), КОМПЛЕКТ2 (Вопрос) и ХЭЛ (р) клетки. 0,1 миллиона инфицированных (GFP+ ) клетки высевали в соотношении 1:1 с неинфицированными клетками в 1-е сутки. Доля GFP+клеток определяли ежедневно. г–р Данные представлены как среднее +/- SEM трех независимых экспериментов. *п< 0,05, **п< 0,01, ***п< 0,001 по Стьюденту ттест.
JAK2V617F-положительные клетки UKE1, SET2 и HEL трансдуцировали лентивирусом с помощью кшРНК JMJD2C или скремблированного контроля. Эффективность трансдукции, определенная анализом FACS на 5-й день, достигла почти 100 % (рис. S3). Нокдаун JMJD2C значительно снижал пролиферацию клеток UKE1, SET2 и HEL через 7–9 дней (рис. 2G-I). Более того, окрашивание аннексином V/PI показало увеличение доли апоптотических и некротических клеток в истощенных клетках JMJD2C (рис. 2J – L, дополнительная рис. S4). Одновременно анализ клеточного цикла выявил снижение доли клеток G2 / M и увеличение доли клеток фазы G1 (рис. 2M – O, дополнительная рис. S5). В анализе конкурентной пролиферации мы смешали JMJD2C истощенные или перемешанные контрольные зараженные клетки кшРНК с неинфицированными клетками в соотношении 1: 1. В то время как скремблированные контрольные инфицированные клетки не показали или показали лишь небольшое снижение пролиферации по сравнению с неинфицированными клетками, доля клеток, истощенных по JMJD2C, быстро уменьшилась, что указывает на то, что снижение уровней JMJD2C создает пролиферативный недостаток (рис. 2P-R). Напротив, в JAK2V617F -отрицательные клетки K562 и U937, истощение JMJD2C не влияло на пролиферацию, апоптоз или прогрессирование клеточного цикла и не приводило к конкурентным недостаткам (дополнительная рис. S6). Таким образом, потеря экспрессии JMJD2C избирательно нарушает пролиферацию JAK2.V617Fмутированные клетки, по крайней мере, частично за счет повышенного апоптоза и остановки клеточного цикла.
