Диагностические характеристики респираторов для сбора и обнаружения SARS-CoV-2

Все процедуры, проведенные в этом исследовании, в том числе с участием людей, соответствовали этическим стандартам учреждения и/или национального исследовательского совета, а также Хельсинкской декларации 1964 года и любым последующим изменениям или аналогичным этическим стандартам. Протокол исследования был одобрен Институциональными наблюдательными советами больницы Гуро Корейского университета (номер утверждения: 2021GR0092) и университетской больницы Коньян (номер утверждения: KYUH 2020-12-018-003). Данные, использованные в этом исследовании, описаны в дополнительной информации. Все эксперименты проводили в пяти повторностях (n = 5) в каждом состоянии на протяжении всего исследования.

Сбор и хранение респираторов

Респираторы для лица были взяты у пациентов с инфекцией SARS-CoV-2, выявленной с помощью официальных ПЦР-тестов в Центре лечения COVID-19 Lifestyle, находящемся в ведении больницы Куро Корейского университета и университетской больницы Конъян. У всех пациентов было получено письменное информированное согласие, пациентам было предложено носить респираторы до 4 часов. Клинические образцы для эксперимента были получены от госпитализированных пациентов (n = 72, мужчины 40, возраст = 68,7 ± 12,7 лет), включая лиц с подтвержденным положительным результатом на SARS-CoV-2 (n = 50), а также отрицательный контроль (n = 22), как указано в Таблице 1. Согласованность теста между тестом ПЦР и тестом RCA-flow оценивали с использованием тех же образцов масок, которые представлены в таблице. 2. Однако из-за увеличения количества тестов (ПЦР по сравнению с RCA-потоком) для трех вирусных генов-мишеней (R-, N-, RdRp-гены) и ограниченной доступности извлеченных образцов общее количество положительных образцов сократилось до 26. Таким образом, образцы, использованные в табл. 2 были подмножеством образцов, использованных в таблице 1. Кроме того, образцы масок были успешно собраны у 19 из 50 подтвержденных случаев SARS-CoV-2 в течение трех дней подряд (n = 19), как показано на рис. 3. Все респираторы были сертифицированы KF94 и одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), а также Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Кореи. Эти респираторы были тщательно собраны в стерилизованные пластиковые пакеты и немедленно помещены в морозильную камеру при температуре -80 °C. Образцы, которые не удовлетворяли критериям исключения, были исключены из этого исследования. Критерии исключения для сбора и хранения образцов следующие: (1) если респиратор не носил пациент с подтвержденным COVID-19; (2) Респиратор носили недостаточное время (t > 4 ч); (3) Температура хранения (< 80 °C) не была соблюдена после отбора проб.

Экспериментальная установка

Фигура 1б показан процесс выделения вирусной РНК из респиратора. Для идентификации SARS-CoV-2 мы приняли четыре целевых гена: гены N, E, RdRp и ORF1ab (рис. 1в). Эти гены-мишени используются во многих коммерчески доступных тестах. Например, коммерческие реагенты для ПЦР были приобретены у Seegen. В качестве генов-мишеней использовались реагенты для генов N, E и RdRp. Как показано на рис. 1d, мы приняли два дополнительных теста, основанных на тестах RCA-FL и RCA-flow. Тест RCA-FL представляет собой обычный тест RCA с обнаружением флуоресценции с использованием устройства ПЦР, а поток RCA представляет собой экспресс-тест с использованием образования гидрогеля ДНК в порах микрожидкости.¹⁹. KF94 не уступает N95 в блокировании частиц SARS-CoV-2, поскольку число 94 указывает на эффективность фильтрации. Перед исследованием респираторов пациентов мы исследовали влияние времени ношения респиратора на количество нуклеиновых кислот, собранных с респираторов здоровых людей. Обратите внимание, что выдыхаемый воздух включает различные вещества, такие как ДНК, РНК, экзосомы и различные летучие органические соединения.²⁸.

Бесклеточная ДНК из респираторов

Внеклеточная ДНК (вкДНК) представляет собой подмножество внеклеточной ДНК, циркулирующей в плазме, которая высвобождается из клеток в основном посредством апоптоза, некроза и активной секреции. cfDNA обладает уникальным потенциалом в качестве биомаркера для больных раком или в области пренатальной помощи. Экстрагированную вкДНК количественно определяли с использованием методов системы TapeStation. Недавние исследования обнаружили циркулирующую вкДНК в плазме пациентов с различными типами рака. Распределение вкДНК по размерам в плазме онкологических больных и здоровых доноров было в основном сходным, со средним размером 150–200 п.н.²⁰. Система TapeStation — это признанный автоматизированный инструмент электрофореза для контроля качества образцов ДНК и РНК, который может выполнять автоматический анализ размера, концентрации и целостности посредством полностью автоматизированной обработки образцов. Он представляет собой комплексное решение для полноценного сквозного контроля качества образцов в рамках любого секвенирования нового поколения (NGS) или рабочего процесса Biobank и хорошо подходит для контроля качества образцов ДНК, полученных из клинических данных.

Извлечение препарата вирусной РНК из респираторов

Процесс выделения РНК из респиратора выглядит следующим образом. Внешняя часть собранной маски была обрезана для извлечения внутреннего электретного фильтра, который впоследствии был обрезан до размеров 50 мм × 50 мм. Затем разрезанный респиратор помещали в 5 мл тризола, инкубировали при комнатной температуре (24 °С) в течение 10 мин и переворачивали. Затем весь раствор сливали из респиратора с помощью ультрацентрифуги. Затем распределите по 200 мкл хлороформа в пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл смеси, извлеченной из респиратора. Смесь перемешивали в течение 15 с и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования при 12000×г и 4°С в течение 10 мин, выделяли только прозрачный супернатант. Смешайте 500 мкл изопропанола с супернатантом, перемешайте смесь и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугируйте образцы снова при 12000×г и 4 ° C в течение 10 мин, затем удалите супернатант. Остальной процесс был таким же, как и обычный. После добавления 1 мл 75% этанола к РНК, с которой удаляли супернатант, смесь перемешивали и проводили центрифугирование при 7500×.г4 °C в течение 5 мин, затем супернатант (этанол) удаляли и дважды промывали в зависимости от образца. Далее крышку смеси открывали и сушили 5–10 мин (до полного удаления этанола). Наконец, после дозирования и пипетирования 15 мкл воды, свободной от РНКазы (DW), смесь инкубировали при 65 ° C на нагревательном блоке в течение 10 минут, а затем инкубировали на льду в течение 2 минут для выделения РНК. После извлечения РНК из респиратора для сбора вирусов ее количественно определяли с помощью нанокапель и оценивали распределение фрагментов по размерам с помощью прибора TapeStation 4200 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).

ПЦР-тест с образцами респираторов

В этом исследовании мы приобрели коммерческий набор для обнаружения SARS-CoV-2 (Allplex™ SARS-CoV-2 Assay, Seegene, Seoul, Korea), который был одобрен FDA в качестве коробки с диагностическими реагентами COVID-19 для экстренного использования. Этот продукт представляет собой диагностический набор COVID-19 для амплификации генов в режиме реального времени (RT-PCR), который обнаруживает три целевых гена (E, RdRp, N) для подтверждения инфекции SARS-CoV-2. В Южной Корее он был одобрен для использования в экстренных случаях Министерством безопасности пищевых продуктов и лекарств. Аллель-специфическую амплификацию проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени (CFX96 Touch™ Real-Time PCR, Bio-Rad) следующим образом: Сначала готовили реакционную мастер-микс. Мастер-микс содержит 5 мкл SARS2 MOM, 5 мкл EM85 и 5 мкл воды, не содержащей РНКазы, при этом общий объем мастер-микса составляет 15 мкл. Общее количество каждого необходимого реагента рассчитывается на основе количества реакций, включая образцы и контроли. Встряхните мастер-микс и ненадолго отцентрифугируйте; добавить 15 мкл реакционного раствора в 0,1 мл 8-пробирочные пробирки (MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip, 0,1 мл, Applied Biosystems™); добавить 5 мкл нуклеиновой кислоты из каждого образца в пробирку, содержащую мастер-микс реакции. Закройте 8-полосную крышку (MicroAmp™ Optical 8-Tube Cap Strip, Applied Biosystems™) и ненадолго отцентрифугируйте пробирку для ПЦР. Жидкость, содержащая все компоненты ПЦР, находится на дне каждой пробирки для ПЦР.

Термический профиль был настроен следующим образом: 20-минутные циклы при 50°С, 15-минутные циклы при 95°С, затем 45 циклов при 95°С в течение 10 с, 60°С в течение 15 с и, наконец, 72°С в течение 10 с. с. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Maestro с порогом цикла (Ct), установленным на 200.

Тест RCA-потока

Интегрированная микрожидкостная система и результаты ее обнаружения показаны на рис. 4. Микрожидкостная система может работать сама по себе без какого-либо оборудования, такого как шприцевой насос или соединительная трубка. Поскольку уровень жидкости в камере для проб выше, чем уровень жидкости в другой камере, поток движется под действием силы тяжести, прокалывая резиновую крышку. Однако, когда в образце присутствует целевой патоген, такой как SARS-CoV-2, образуется гидрогель, который закупоривает микропоры в сетке.²⁹. Из-за небольшого размера микропор в нейлоновой сетке (около 1 мкм) эти микропоры быстро блокируются запутыванием ДНК в процессе RCA. Фигура 4c и d показывают СЭМ-изображения нейлоновой сетки при большом увеличении, а на рис. 4f показывает фотографию гидрогеля, образованного реакцией RCA с РНК, полученной из клинических образцов респираторов. Примечательно, что в отсутствие патогенов имел место естественный поток под действием силы тяжести, и повторные тесты показали очень хороший коэффициент вариации (< 5%) для времени миграции.

Диагностические характеристики респираторов с RCA-потоком

Чтобы подтвердить обнаружение SARS-CoV-2 с использованием клинических образцов, мы сравнили результаты молекулярной диагностики с методом RCA. Каждая из пробирок с нейлоновой сеткой, связанной с праймером, была вставлена ​​в микрожидкостный набор. Это может быть подтверждено информацией в нашем предыдущем исследовании¹⁴. Кроме того, образец нуклеиновой кислоты из респиратора здорового человека называли отрицательным контролем. Путь потока через обычный респиратор (отрицательный контроль) не был полностью заблокирован при определенном времени инкубации 30 минут путем индивидуального помещения конкретного патогена COVID-19 во вход обоих микрожидкостных наборов для достижения быстрого потока (~ 17 с) через пробирку (рис. 4г). Однако путь потока, через который клинический образец пациента с подтвержденным коронавирусом прошел через нейлоновую сетку с праймером, был полностью заблокирован, и поток не возникал на всем протяжении пробирки (рис. 4час).

Для теста потока RCA использовалась микрожидкостная система, разработанная в нашем недавнем исследовании.^20,21. Система состоит из камеры для образцов, стеклянной трубки, зонда с навесным замком, соединенного нейлоновой сеткой, и камеры для отходов с резиновой крышкой. Поскольку камера для отходов закрыта резиновой крышкой, проба, загруженная в камеру для проб, не может течь через трубку. Когда резиновый колпачок соединен с атмосферой, проба жидкости направляется в камеру для отходов благодаря повышенному гидростатическому давлению в камере для проб. В этом тесте потока RCA мы используем очень тонкую сетку, на которой фиксированные зонды висячих замков захватывают целевой ген. Гибридизация происходит, когда зонд сталкивается с целевым патогеном. Зонд открытого замка лигируют с использованием лигазы (лигазы Т4, 12,5 мкМ) с образованием шаблона с замкнутым контуром, который затем можно приступить к процессу RCA. Со временем в процессе RCA комплементарная одноцепочечная ДНК удлиняется до формы гантели с помощью ДНК-полимеразы Bst 3.0. Из-за матрицы в форме гантели амплифицированная длинная ДНК имеет тенденцию легко запутываться, агрегировать с соседней ДНК и образовывать гели ДНК. В результате гидрогель частично или полностью закупоривает микропоры сетки; таким образом, в зависимости от степени, в которой гидрогель закупоривает микропоры, происходит задержка потока или его отсутствие. Подробная информация доступна в наших предыдущих статьях^20,21.