Инфицирование шиповидным псевдовирионом SARS-CoV-2 в клетках ARPE-19 представляет собой динамин-зависимый процесс, который в первую очередь опосредуется LDLR.

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Международный журнал молекулярных наукисследователи сообщили, что лентивирусные псевдовирионы, псевдотипированные с шипом коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) (S) гликопротеин может инфицировать культивируемые клетки пигментного эпителия сетчатки человека ARPE-19.

В исследовании изучается, как эта инфекция может быть заблокирована антителами против рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDLR), антителами против кавеолина-1, анти-динамина, агентами, снижающими уровень холестерина, и малыми интерферирующими молекулами рибонуклеиновой кислоты (миРНК) LDLR.

Изучать: Рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) участвует в интернализации лентивирусных частиц, псевдотипированных шиповидным белком SARS-CoV-2, в клетках глаза. Изображение предоставлено: ФОТОКРЕМихал Беднарек/Shutterstock.com

Фон

Попадание SARS-CoV-2 в хозяина происходит через рецептор ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2). Тем не менее, низкая экспрессия ACE2 все еще может инфицировать ткани и клетки, такие как жировая ткань и склера глаза. SARS-CoV-2 также может независимо инфицировать Т-лимфоциты и эпителиальные клетки.

Дополнительные рецепторы, такие как AXL, нейропилин-1, басигин, рецептор ангиотензина II типа 1 (AT1) и рецептор вазопрессина V1b (AVPR1B), способствуют проникновению в разные клетки. В недавних исследованиях были идентифицированы эндоцитарные пути, такие как клатринзависимый и кавеолозависимый пути.

Другие рецепторы-кандидаты, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), AXL и LDLR, также были предсказаны.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи обнаружили, что кавеолы ​​и рецепторы ЛПНП в кавеолах являются компонентами механизма эндоцитоза, зависимого от рецептора SARS-CoV-2, который используется для заражения определенных органов, включая клетки глаза.

Исследователи исследовали, где SARS-CoV-2 входит в модель культуры клеток RPE, ARPE-19, и участвуют ли богатые холестерином липидные рафты в заражении SARS-CoV-2 клеток пигментного эпителия сетчатки человека ARPE-19.

Были исследованы антитела против виментина и дополнительные предполагаемые потенциальные рецепторы для SARS-CoV-2-нейролипина-1, EGFR, AXL и кластера дифференцировки 147 (CD147).

Мы использовали циклодекстрины и оксистеролы для нарушения гомеостаза холестерина в клетках пигментного эпителия сетчатки. Клетки ARPE-19 инкубировали с 0,0–10,0 М 25-HC после заражения псевдотипированными лентивирусными частицами с нативным шипом SARS-CoV-2.

Ловастатин использовали для оценки наличия холестерина. За шестичасовой преинкубацией только с ловастатином в концентрации от 0,0 до 10,0 М следовал 48-часовой период совместной инкубации с ловастатином и псевдовирионами.

Затем исследователи проверили, отвечает ли агонистическая активность 25-HC на рецепторах LXR за предотвращение вирусной инфекции путем предварительной инкубации клеток с 0,0–10 мкМ синтетического агониста LXR GW3965.

Исследователи использовали хлорпромазин (CPZ), катионное амфипатическое химическое вещество, используемое в микромолярных концентрациях (от 50 до 100 М), для блокирования CME нескольких белков плазматической мембраны. Затем исследователи использовали антитело против кавеолина-1 для изучения эндоцитоза, зависимого от кавеол.

Антитела против LDLR использовались для исследования гипотезы рецептора липопротеинов низкой плотности. Исследователи оценили положительную селекцию рецепторов ACE2 и LDLR, чтобы изучить адаптивную эволюцию вирусных рецепторов SARS-CoV-2 в ответ на вирусную инфекцию.

Псевдовирус Анализ инфекции и жизнеспособности клеток, иммуноблот-анализ, количественная полимеразная цепная реакция (КПЦР) и множественный анализ выравнивания были выполнены на клетках пигментного эпителия сетчатки человека, обработанных миРНК, и инфицированных псевдовирионами.

Полученные результаты

Полученные данные показали, что интернализация SARS-CoV-2 в клетках ARPE-19 происходила посредством опосредованного кавеолами эндоцитоза через LDLR.

Терапия антителами для подавления ACE2 не смогла предотвратить инфицирование псевдовирионом S-белка SARS-CoV-2, а также не предотвратила блокировку внеклеточных белковых плотных белков с высоким содержанием холестерина, таких как виментин.

Группа также продемонстрировала, что различные оксистерол-25-гидроксихолестерол (25-HC) и циклодекстрины уменьшают инфекцию псевдовириона в клетках ARPE-19, что указывает на роль гомеостаза холестерина в инфекции.

Однако, поскольку инкубация с ловастатином не оказывала заметного влияния на инфекцию, действие 25-HC, скорее всего, не было связано с образованием холестерина. Плоты на основе флотилина и клатрина не были вовлечены в заражение псевдовирионом.

Антитела против динамина I и II и диназора, неконкурентного ингибитора динамин-гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы), предотвращали проникновение псевдовириона S-гликопротеина SARS-CoV-2.

Антитела против кавеолина-1 значительно ингибировали спайк-гликопротеин-псевдотипированную лентивирусную инфекцию SARS-CoV-2 в клетках пигментного эпителия сетчатки человека. Однако нистатин, хорошо известный ингибитор эндоцитоза на основе кавеол, не влиял на инфекцию во всех дозах.

Также не было выявлено значительного влияния GW3965 на спайк-псевдотипированную лентивирусную инфекцию SARS-CoV-2 клеток пигментного эпителия сетчатки до концентрации 5,0 мМ.

Ингибирующее действие хлорпромазина и флунаризина на инфицирование псевдовирионами наблюдалось через 24,0 часа, но не через 48,0 часов. Полученные данные показали, что псевдовирионная инфекция шиповидного гликопротеина SARS-CoV-2 основана на динамине и в значительной степени регулируется LDLR клеток сетчатки, что подтверждается генетическим сайленсингом с использованием малых интерферирующих молекул РНК, нацеленных на LDLR.

Наблюдалось статистически значимое снижение количества псевдотипированных лентивирусных инфекций SARS-CoV-2 с шипами гликопротеина SARS-CoV-2 после лечения молекулами малой интерферирующей РНК рецептора липопротеина низкой плотности по сравнению со скремблированными молекулами малой интерферирующей РНК или пустой трансфекцией.

Экспрессия рецепторов липопротеинов низкой плотности в клетках показала линейную корреляцию с поглощением шиповидных гликопротеиновых псевдотипированных лентивирусных частиц.

Заключение

Основываясь на результатах исследования, опосредованный кавеолами трансцитоз вирусов, связанных с рецептором ЛПНП, вероятно, представляет собой альтернативный механизм интернализации SARS-CoV-2 в клетках, лишенных ACE2, таких как ARPE-19.

Ученые предположили, что участие рецепторов ЛПНП в метаболической дисфункции может увеличить риск развития тяжелого заболевания COVID у людей с ожирением и диабетом, что требует дальнейших исследований.