Реагенты
Необычные реагенты, их коммерческие источники и каталожные номера представлены в дополнительной таблице S1.
Культура клеток
Клетки Vero E6 почки африканской зеленой мартышки и клетки эмбриональной почки человека 293 (HEK293) культивировали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (hiFBS), 1% L-глутамина и 1% пенициллина. /стрептомицин (ПениСтрепт). Клетки карциномы толстой кишки человека Caco2 культивировали в минимальной необходимой среде (MEM), содержащей те же добавки, что описаны для клеток Vero E6. Эти среды для культивирования клеток далее называются полноценными средами. Все клетки культивировали при 37°C в атмосфере с 5% CO2.
Инфекция SARS-CoV-2 клеток Vero E6 и Caco-2
Кверцетин растворяли в ДМСО, а затем разводили до различных концентраций в лечебной среде (DMEM или MEM плюс 2% hiFBS, 1% L-глютамин, 1% PeniStrept). Клетки VeroE6 и Caco2 культивировали в трех экземплярах в 24-луночных планшетах в полной среде. Когда клетки достигали 80–90% слияния, среду удаляли и заменяли 500 мкл лечебной среды. После инкубации в течение 1 часа клетки инфицировали добавлением 250 мкл среды, содержащей SARS-CoV-2/Canada/ON-VIDO492 01/2020 (номер доступа GISAID EPI_ISL_425177), для множественности заражения (MOI) 0,1. Конечные концентрации кверцетина в каждой повторности составляли 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 мкМ, а конечная концентрация ДМСО составляла 0,3% об./об. Контрольные клетки обрабатывали эквивалентным объемом обрабатывающей среды, содержащей 0,3% об./об. ДМСО, но без кверцетина. Клетки инкубировали при 37°C в 5% CO2 в течение 48 часов, а затем собирали супернатант для количественного определения вирусной РНК.
Для количественного определения инфекционного SARS-CoV-2 клетки Vero E6 высевали в 96-луночный планшет так, чтобы на следующий день слияние составляло ~ 95%; супернатанты из двух независимых исследований по лечению лекарственными средствами (проведенных как на клетках Vero E6, так и на клетках Caco2) серийно разводили в 10 раз в DMEM, содержащей 2% hiFBS и 1% L-глутамин, и 100 мкл каждого разведения использовали для инокуляции клеток в трех экземплярах; клетки инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение семи дней, после чего их оценивали на цитопатический эффект (CPE). Медианную инфекционную дозу в культуре ткани (TCID50) на мл рассчитывали для каждого образца супернатанта с использованием метода Рида и Мюнха. Поскольку самая высокая концентрация (800 мкМ) кверцетина, использованная в клетках Caco2, привела к CPE в одной из трех лунок при самом низком используемом разведении (10 – 1), мы не смогли рассчитать TCID50 для этого образца. Вместо этого образцу было присвоено значение предела обнаружения, которое было рассчитано исходя из предположения, что разведение 100 привело бы к образованию трех из трех лунок с CPE.
Все работы с инфекционным вирусом проводились в помещении уровня защиты 3 (CL-3) Национальной микробиологической лаборатории (NML) Агентства общественного здравоохранения Канады (PHAC) в Канадском научном центре здоровья человека и животных (CSCHAH), Виннипег, Канада. Все процедуры проводились в соответствии со стандартными операционными протоколами, подходящими для данного уровня биобезопасности.
Трансфекция клеток HEK293
Векторы экспрессии включают следующие плазмиды: (i) pEGFP-C1 для экспрессии eGFP (далее сокращенно pGFP); (ii) pcDNA3.1-hACE2-C9 для экспрессии человеческого ACE2 с меткой C9 на его C-конце (далее сокращенно pACE2); (iii) 2019-nCov-Linker_pcDNA3.1(+)-C-eGFP для экспрессии шиповидного белка SARS-CoV-2, слитого через линкерный пептид с C-концевым усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP) (далее сокращенно pS -GFP); (iv) 2019-nCov_pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP для раздельной экспрессии белка Spike и eGFP (далее сокращенно называемого pS-P2A-GFP). Пептид P2A, помещенный непосредственно перед глицином, заставляет рибосому пропускать образование пептидной связи между глицином и следующей аминокислотой. [25], что позволяет транслировать Spike и eGFP одновременно, но как два неслитых белка. Большинство экспериментов проводили с двумя векторами экспрессии. При использовании одного вектора экспрессии в pcDNA-3 добавляли пустой вектор (EV) для выравнивания количества трансфицированной ДНК.
Трансфекцию плазмиды проводили с использованием реагента для трансфекции jetPRIME® в соответствии с протоколом производителя. Векторы трансфекции представляли собой смесь pACE2 и pS-GFP в соотношении 1:1, смесь pACE2 и pGFP в соотношении 1:1 или смесь pS-GFP и pcDNA3 в соотношении 1:1 в качестве EV. В типичном эксперименте клетки культивировали в полной среде в виде монослоев в 96-луночных планшетах; использованную среду удаляли и заменяли 100 мкл/лунку смеси jetPRIME® и полной среды в соотношении 1:9. После 4-часовой инкубации среду для трансфекции удаляли; монослои клеток промывали полной средой; затем к ним добавляли полную среду, содержащую 0,2% ДМСО (контроль) или различные микромолярные концентрации кверцетина и 0,2% ДМСО; их далее инкубировали в течение 16 часов.
IncuCyte захватывает образование синцития и флуоресценцию
Клетки высевали на 96-луночные планшеты с черным/прозрачным дном (Corning) с плотностью 30000 клеток/лунку в трех экземплярах для каждого условия. После 24-часовой инкубации их трансфицировали, обрабатывали и обрабатывали, как описано выше в разделе «Трансфекция клеток HEK293». Систему анализа живых клеток IncuCyte® S3 (Essen BioScience) использовали для захвата изображений флуоресценции, излучаемой eGFP, из каждой лунки каждые 4 часа в течение до 48 часов с объективом 4×, зеленым/красным оптическим модулем 4614 и 300-кратным объективом. Экспозиция мс. Ингибирование синцитиализации сопровождалось снижением флуоресценции. Чтобы определить половину ингибирующей концентрации (IC50) кверцетина при образовании синцития, интегральную интенсивность флуоресценции. [Green Calibrated Unit (GCU) x µm²/well) at 20 h post-transfection (16 h post-treatment) was quantified and normalized against that of DMSO-treated control cells.
Confocal microscopy
Transfected HEK293 cells were seeded in an 8-chamber slide at a density of 82 500 cells/chamber and incubated for 24 h. They were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min, washed twice with phosphate buffered saline (PBS), incubated with Hoechst (diluted 1:7500 in PBS) for 10 min to stain DNA, washed again twice, and then overlaid with 300 µl of PBS/chamber. Images were acquired using the AxioObserver LSM700 inverted confocal microscope; (Zeiss) with a 20× objective and processed using the Zen 3.4 software. Excitation/emission wavelengths were 405/435 nm for Hoechst and 488/518 nm for eGFP. For best localize eGFP fluorescence in syncytia, the laser power at 488 nm had to be doubled for HEK293(S + ACE2) cells treated with 0 to 100 µM quercetin to compensate for the reduced fluorescence due to cell fusion. Images were captured with a resolution of 2048 × 2048 pixels.
Cell viability assay
Quercetin cytotoxicity was assessed in VeroE6 and Caco2 cells. Quercetin was dissolved in DMSO and then diluted to various concentrations in treatment medium (DMEM or MEM, plus 2% hiFBS, 1% L-Glutamine, 1% PeniStrept). Cells were seeded in triplicate in a 96-well plate. Upon reaching 80–90% confluency, medium was removed and replaced with 100 µl treatment medium. Following a 1-h incubation at 37 °C, an additional 50 µl of treatment medium was added. The final concentrations of quercetin were 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, and 400 µM, and the final concentration of DMSO in each replicate was 0.3% v/v. Control cells were treated with an equivalent volume of treatment medium containing 0.3% v/v DMSO but no quercetin. After 48 h of drug treatment, cells were washed once with PBS, and cell viability was assessed using the CyQUANT™ XTT Cell Viability Assay kit according to manufacturer’s directions.
HEK293 cells were seeded in a 96-well plate at a density of 3 × 104 cells/well and incubated for 24 h; the medium was supplemented with DMSO to a final concentration of 0.2% (v/v, controls) or to varying micromolar concentrations of quercetin and final 0.2% DMSO; incubation was resumed for 24 h. Cell viability was measured using the Abcam MTS Cell Proliferation Assay kit. The assay is based on the reduction of a tetrazolium salt to a colored formazan by live cells. Briefly, complete media containing DMSO or quercetin and DMSO was removed and replaced with 110 µl/well of a 1:9 mix of MTS reagent: complete medium; the plate was incubated at 37 °C for 180 min; the plate was shaken at 600 rpm for 30 s at room temperature (23 °C) and the optical density (OD) at 490 nm was measured for each well using a Multiskan Spectrum plate reader (Thermo Electron Corporation). The average OD of wells without cells was subtracted from the ODs of cell-containing wells. All assays were conducted in triplicates.
Quantification of SARS-CoV-2 RNA
SARS-CoV-2 RNA was extracted from cell culture supernatant using the QIAamp Viral RNA Mini Kit according to the manufacturer’s instructions. Viral RNA was quantified by reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) using the LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probes kit and the QuantStudio3 thermal cycler. Primer and probe sequences were specific for the SARS-CoV-2 E gene:
forward primer, 5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’;
reverse primer, 5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’; and.
probe, 5’-FAM-ACACTAGCCATCCTTACT GCGCTTCG-BBQ-3’.
Cycling conditions were as follows: 63 °C for 3 min and 95 °C for 30 s, followed by 45 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 30 s.
In vitro assay for spike-ACE2 interaction
On a 96-well plate, each well was coated with 50 µl of 1 µg/ml of Spike Protein overnight at 4 ̊C; wells were then washed and blocked. Stock solutions of test compounds were prepared: quercetin at 10 mM in DMSO and anti-Spike antibody at 500 nM in PBS. To each well, 10 µl of diluted test compound and 20 µl of 1× immune buffer (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.5% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, pH 7.5) were mixed and allowed to incubate at room temperature (RT) for 1 h; 20 µl of ACE2-His (2.5 ng/µl) were added and incubation resumed for 1 h; wells were washed three times with immune buffer and blocked with Blocking Buffer 2 for 10 min; 100 µl of Anti-His-HRP were added to all wells which were incubated for 1 h; wells were emptied, washed three times and blocked before the addition of 100 µl of freshly prepared HRP chemiluminescent substrates; the luminescence intensity of the samples was measured in a BioTek Synergy 2 microplate reader. The luminescence values in the presence of a test compound were expressed as % of the values obtained in the absence of the compound.
Immunoblotting
For the immunoblotting (IB) experiments, 2.5 × 106 cells in 4 ml of complete medium were seeded in 60 mm plates. After a 24-h incubation, they were transfected, processed, and treated as described above under “Transfection of HEK293 cells”. Cell monolayers were washed with PBS; they were scraped off the plates and suspended in 1 ml of PBS; they were rinsed with PBS through two cycles of centrifugation at 1020 g for 3 min. Cell pellets were lysed in 50 µl of IP buffer [PBS, 0.3% n-dodecyl β-D-maltoside (DDM), 20 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1x Protease Inhibitor Cocktail (PIC)]; лизаты диспергировали посредством 30-секундного цикла включения/30-секундного отключения ультразвука на водяной бане при 4 ° C в течение 3 минут при высокой интенсивности с использованием ультразвукового аппарата Diagenode (UCD-200TM). Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка Bio-Rad Bradford.
Для IB в клеточные лизаты (10 мкг) добавляли 0,25 объема 4× буфера для образцов Лэммли и 0,1 объема β-меркаптоэтанола (конечный объем 10% по объему); их нагревали при 55°С в течение 10 мин. Белки фракционировали на 8% или 10% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ). Мембрану блокировали в трис-буферном физиологическом растворе (TBS, 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,6), содержащем 5% молока-0,1% Твина (блокирующий раствор), в течение 1 часа. Сначала его инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичным антителом в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем в течение 1 часа при комнатной температуре с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в блокирующем растворе. Мембрану исследовали на реакцию HRP с использованием набора Bio-Rad Clarity Western ECL Substrate Revelation Kit. Полосы были сняты с помощью системы визуализации Bio-Rad ChemiDoc и проанализированы денситометрически с помощью программного обеспечения Bio-Rad Image Lab. Денситометрические значения полос ACE2 и Spike-GFP были нормализованы по значениям для β-актина, принятого в качестве внутреннего стандарта содержания белка.
Фурин in vitro анализ
Анализ проводили с использованием набора для анализа фуриновой протеазы BPS Bioscience в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 50 мкл реакционной смеси в 25 мМ Трис/1 мМ CaCl2, 0,5% мас./об. Brij-35, pH 9,0 (буфер для анализа) готовили с 50 нг рекомбинантного растворимого человеческого фурина, 10 мкл кверцетина в различных концентрациях в 10% ДМСО (конечный 1%); смесь выдерживали при комнатной температуре 30 мин; затем к нему добавляли 50 мкл 4 мкМ субстрата фурина PyroGlu-Arg-Thr-Lys-Arg-4 метилкумарил-7-амида (Pyr-RTKR-AMC) в буфере для анализа и далее инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. температура. Интенсивность флуоресценции, возникающую в результате расщепления субстрата, измеряли при возбуждении 380 нм и эмиссии 460 нм с использованием микропланшет-ридера Tecan Infinite M1000. Ингибирующую активность кверцетина выражают в % относительно контрольного показателя (100%). Деканоил-Arg-Val-Lys-Arg-хлорметилкетон (Dec-RVKR-CMK), подтвержденный ингибитор фурина, использовали в качестве положительного контроля ингибирования.
статистический анализ
Количественные значения выражаются как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Они были рассчитаны и статистически сопоставлены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием GraphPad Prism версии 9.5.1. Достоверность различий между экспериментальными группами устанавливали на уровне р < 0,05.
2024-01-25 16:46:59
1706201861
#Кверцетин #ингибирует #инфекцию #SARSCoV2 #предотвращает #образование #синцития #клетками #совместно #экспрессирующими #вирусный #спайковый #белок #человеческий #ACE2 #Вирусологический #журнал