В недавней статье, размещенной на биоRxiv* сервер препринтов, исследователи изучили движущие факторы сборки вируса коровьей оспы в инфицированных клетках.
Фон
Вирус натуральной оспы, вызывающий оспу и оспу обезьян, является примером поксвирусов, вызывающих заболевания у людей. Другие поксвирусы, такие как модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) и вирус осповакцины, используются в качестве вакцинных векторов.
Кроме того, эти обширные вирусы с двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) реплицируют и собирают свои вирионы на перинуклеарных вирусных фабриках в цитоплазме. В цитоплазме инфицированных клеток вирус коровьей оспы и другие поксвирусы, включая оспу обезьян, впервые собирают сферические неинфекционные незрелые вирионы (IV). Вирусная решетка D13 полностью покрывает мембрану IV, включая геном ДНК и вирусные белки. После потери решетки D13 IV развивается во внутриклеточный зрелый вирус (IMV) в форме кирпича, который имеет хорошо организованное ядро, охватывающее геном.
Несмотря на их значение, до сих пор неясно, как инфекционные поксвирусные вирионы концентрируются в цитоплазме инфицированных клеток. Первичные структурные факторы, которые контролируют изменения, возникающие при преобразовании IV в IMV, и те, которые характеризуют IMV, еще не определены.
Об исследовании
В настоящем исследовании исследователи использовали криоэлектронную томографию (крио-ЭТ) замороженных гидратированных клеток, инфицированных осповакциной, чтобы структурно определить процедуру созревания сферических внутривенных вливаний в инфекционные IMV в форме кирпича. местный.
Авторы создали рекомбинантные штаммы коровьей оспы Western Reserve (WR), в которых отсутствовал F11, поскольку это препятствует объединению инфицированных клеток на ранних стадиях инфекции для проведения исследований с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Далее были получены криотомограммы ИМВ и ВВ-содержащих тонких клеточных участков с краев клеток HeLa, подвергшихся воздействию вируса коровьей оспы в течение восьми часов. Выделенный рекомбинантный D13 был проанализирован структурно, чтобы получить полное молекулярное представление о тримере D13.
Кроме того, команда оценила структуру IMV в инфицированных клетках. Они провели независимое усреднение субтомограмм с внутриклеточными оболочечными вирионами (IEV), IMV, внеклеточными оболочечными вирионами (EEV) и частицами клеточно-ассоциированного оболочечного вируса (CEV) для изучения структуры частокола. Чтобы лучше понять механизм гофрирования во время созревания ВВ до ИМВ, исследователи оценили периметр вирусной мембраны в средней плоскости среди ВВ и ИМВ, следуя морщинам вирусной мембраны, чтобы определить длину ее контура.
Полученные результаты
Команда обнаружила, что IV с покрытием D13 имеет такие же размеры и диаметры решетки, что и сферические ансамбли D13, созданные в пробирке, доказывая, что D13 контролирует размер IV. Они обнаружили, что часть внутривенного введения с покрытием D13 демонстрирует расширенную инвагинацию мембраны, несмотря на относительно постоянный диаметр. Хотя искажения мембраны IV были замечены в некоторых исследованиях, эта характеристика практически не упоминалась в более ранних экспериментах с ЭМ, визуализирующих тонкие срезы.
Новая псевдогексагональная решетка развивается внутри IV во время генерации IMV, образуя вирусное ядро. Эта решетка состояла из трехмерных столбов с выступами наружу, напоминающими в поперечном сечении частокол. Примечательно, что диаметр IV точно совпадает с длинной осью IMV, что указывает на длину ядра. Таким образом, авторы отмечают, что решетка D13 регулирует IMV.
Ученые обнаружили, что сферический IV сбрасывает свою D13-оболочку и уменьшает свой объем примерно на 50% во время созревания до IMV. Между тем, на вирусной мембране образуются гофры, поскольку она соответствует форме боковых тел и капсидоподобного палисадного слоя, которые составляют ядро. Этот вывод показывает, что удаление мембраны не было необходимым для компенсации 50% уменьшения объема, которое происходит при переходе с внутривенного введения на внутривенное.
Кроме того, частокол представлял собой непрерывную правильную решетку с псевдогексагональной симметрией, полностью покрывающую вирусное ядро и очерчивающую его границы. Кроме того, этот палисад, который не изменяется при последующем морфогенезе вириона, в основном состоит из А4 и р4А. Эта новая вирусная решетка также определяет размеры и форму IMV.
В совокупности результаты исследования подразумевают, что последовательные решетки D13 и палисад структурно определяют сборку и созревание осповакцины.
Выводы
В настоящей работе команда применила крио-ЭТ для визуализации тонкой периферии глубоко замороженных клеток, инфицированных вирусом коровьей оспы, с отображением структуры вируса. местный. Исследование дает общую картину созревания вируса коровьей оспы от IV до IMV, но структурные знания все еще отрывочны.
Текущее высокое разрешение местный наблюдения выявили новые черты внутреннего ядра зрелых вирионов и вирусной мембраны вируса коровьей оспы. Возникающая гипотеза предполагает, что сборка IMV управляется последовательностью двух различных вирусных решеток: D13 формирует мембрану IV, которая позже срастается с псевдогексагональной палисадной решеткой, напоминающей вирусный капсид.
*Важное замечание
bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.
