Обнаружение и количественное определение Plasmodium falciparum в крови человека с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией: исследование, подтверждающее концепцию | Журнал о малярии

Выводы по отношению к существующей литературе

Это исследование обеспечивает подтверждение концепции использования MALDI-TOF для идентификации и количественной оценки П. фальципарум в человеческой крови. Несмотря на широкое применение в клинической микробиологии, MALDI-TOF обычно не используется в паразитологии. [12]. Предыдущие исследования предоставили ранние доказательства способности MALDI-TOF идентифицировать различные Giardia, Cryptosporidium, Blastocystis, Entamoeba, Leishmania, Trichomonas и Trichinella. разновидность [12,13,14]. Как и нынешнее исследование, большинство предыдущих исследований проводились на культивируемых паразитах, а не на клинических образцах. Для Плазмодий spp., ранее предпринимались попытки обнаружить гемозоин с использованием технологий, аналогичных MALDI-TOF, используемому в текущем исследовании. [15, 16]. Эти исследования показали, что гемозоин можно обнаружить, но чувствительность была слишком низкой для клинического применения. [15,16,17]. Помимо технических различий в этих исследованиях, основное отличие состоит в том, что метод, используемый в настоящем исследовании, основан на широком диапазоне П. фальципарум белки вместо того, чтобы полагаться на продукт с одним остатком. Теоретически этот подход может обеспечить большую чувствительность и специфичность, чем метод на основе гемозоина. Пики гемозоина были зарегистрированы на расстоянии около 500 m/z, что находится за пределами зоны обнаружения, используемой в текущем исследовании. [17, 18]. Интересным аспектом настоящего исследования является возможность количественной оценки. П. фальципарум. Количественная оценка необходима для информирования пациентов, но в настоящее время микроскопия является единственным клинически применяемым методом. Микроскопия требует много времени, и несколько исследований показали большие различия между наблюдателями. [7, 19]. В текущем исследовании как пиковая интенсивность, так и количество ПлазмодийБыло обнаружено, что -специфичные пики хорошо коррелируют с концентрацией П. фальципарум Обе корреляции могут стать основой для количественной оценки MALDI-TOF. Плазмодий инфекции. Даже если окажется невозможным повысить чувствительность MALDI-TOF до уровня, на котором он сможет заменить молекулярные методы, сочетание количественного определения MALDI-TOF и обнаружения нуклеиновых кислот человека Плазмодий может стать значительным улучшением диагностики малярии с точки зрения точности и времени получения результатов. Кроме того, количественная оценка на основе MALDI-TOF потенциально может использоваться для контроля лечения, что в настоящее время невозможно с помощью молекулярных методов или быстрых диагностических тестов из-за персистенции антигенов и фрагментов ДНК после лечения. [2,3,4,5].

Ограничения исследования

Это исследование было основано исключительно на образцах культивированных биобанков и включало только П. фальципарум. Для изучения клинического применения описанного метода необходимы дальнейшие исследования с использованием клинических образцов. Благодаря конструкции с использованием культурных П. фальципарумв изученных образцах предположительно содержалась более высокая доля паразитов на поздних стадиях, чем ожидалось в клинических образцах. Чтобы объяснить это, культуры были синхронизированы, но паразиты на поздних стадиях все еще обнаруживались при контрольной микроскопии. Неизвестно, как это повлияет на пики, обнаруженные с помощью MALDI-TOF, но недавний комплексный протеомный анализ П. фальципарум показали существенное перекрытие между белками, экспрессируемыми паразитами на кольцевой и поздней стадиях. [20]. С другой стороны, уменьшенное количество пиков, обнаруженных при низких концентрациях паразитов, может быть связано с исчезновением пиков, специфичных для паразитов на поздних стадиях, после разбавления. В данном исследовании спектральный анализ основывался на визуальном осмотре. Хотя этот метод очень полезен на ранних стадиях исследований, он является ограничением для клинического применения метода. В будущих исследованиях ключевым моментом будет создание базы данных, содержащей спектры всех Плазмодий видов, а также других паразитов, передающихся через кровь, для автоматизированного спектрального анализа и дифференциальной диагностики на ходу. Наконец, эталонным методом была микроскопия, и поэтому на результаты влияют ранее описанные ограничения, связанные с этим методом. Эффект особенно важен с точки зрения количественного определения, и было бы интересно дополнить будущие исследования количественной ПЦР или количественным определением антигенов паразитов для более точного эталонного метода.

Перспективы на будущее

Сообщается, что пределы концентрации для идентификации бактерий, передающихся через кровь, с помощью MALDI-TOF составляют 10–1000 бактерий/мкл. [8]. На основе полногеномного секвенирования было подсчитано, что две трети белков, экспрессируемых в П. фальципарум уникальны для организма, их доля выше, чем у других эукариот. [21]. Учитывая это, а также тот факт, что Плазмодий паразиты являются значительно более крупными организмами, чем бактерии, и поэтому предположительно имеют более высокие концентрации белков пр. организм, MALDI-TOF идентификация П. фальципарум должно быть возможно при более низких концентрациях, чем 0,1% IRBC, использованный в этом исследовании. Прямые затраты на идентификацию бактерий с использованием MALDI-TOF оцениваются менее чем в 0,5 доллара США. [22, 23]. С учетом амортизации машины, технического обслуживания и обучения затраты будут варьироваться в зависимости от местных факторов, таких как уровень заработной платы, соглашения на техническое обслуживание, объем выборки и расчетный срок службы платформы MALDI-TOF, но общие затраты оцениваются в пределах 0,7 доллара США. и 3,14 $ [23,24,25]. Если удастся достичь более низкого уровня обнаружения, возможно, что MALDI-TOF позволит реализовать экономически эффективные программы скрининга малярии. Это особенно актуально, если MALDI-TOF доказывает возможность обнаружения гаметоцитов, поскольку эту стадию паразита легко пропустить с помощью микроскопии, и для идентификации необходимы передовые методы ПЦР. Для дальнейшего изучения этих перспектив необходимы будущие исследования, посвященные усовершенствованным протоколам экстракции, настройкам MALDI-TOF и компонентам матрицы. Если будущие исследования подтвердят применимость MALDI-TOF в программах диагностики и скрининга пациентов, программы скрининга потенциально можно будет сочетать с программами борьбы с переносчиками инфекции. Растущее число исследований демонстрирует, что MALDI-TOF может различать разные виды Анофелес комары, а в 2017 г. Laroche et al. использовал MALDI-TOF, чтобы различать Анофелес стефенси с и без Плазмодий горной пустоши инфекционное заболевание [13, 14, 26]. Еще одна интересная перспектива – выявление устойчивости к противомалярийным препаратам. Различение бактериальных штаммов с разным профилем устойчивости на основе характерных пиков спектров MALDI-TOF возможно для широкого спектра бактерий. [27, 28]. В настоящее время не разработан клинически значимый метод выявления устойчивости к противомалярийным препаратам, поэтому устойчивость к противомалярийным препаратам обычно выявляется после неэффективности лечения. [29, 30]. Перспективой тестирования устойчивости на основе MALDI-TOF будет целевое использование противомалярийных препаратов и лучший надзор за развитием устойчивости. Для изучения этой точки зрения необходимы будущие исследования. Наконец, пики, обнаруженные в спектре MALDI-TOF, представляют собой белки, экспрессируемые Плазмодий паразит. Расширенное использование MALDI-TOF могло бы идентифицировать белки, которые в большом количестве экспрессируются, и могло бы направлять исследования с использованием более продвинутых протеомных платформ для дальнейшей характеристики этих белков.

Барьеры для клинического использования

Это исследование следует рассматривать как исследование на ранней стадии, и необходимы будущие исследования для установления основных параметров, таких как чувствительность, специфичность и пределы обнаружения в клинической популяции, перед клиническим применением. Во-вторых, необходимо улучшить пределы обнаружения, чтобы они могли конкурировать с чувствительностью используемых в настоящее время методов, таких как экспресс-тесты и микроскопия. Пределы обнаружения для микроскопии и БДТ варьируются в зависимости от производителя теста и навыков микроскописта. [7, 31]. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, пределы обнаружения микроскопии в типичных полевых условиях составляют 100 паразитов на мкл, и рекомендует использовать экспресс-тесты только в том случае, если они имеют чувствительность> 75% при 200 паразитах на мкл. [7]. 0,1% IRBC, используемый в этом исследовании, соответствует 5000 паразитов на мкл, поэтому необходима повышенная чувствительность. Наконец, доступность платформ MALDI-TOF станет барьером во многих эндемичных странах. MALDI-TOF считается основным стандартным оборудованием для микробиологических лабораторий в странах с высоким уровнем дохода, и доступность этого оборудования растет в странах с низким и средним уровнем дохода. Тем не менее, MALDI-TOF в настоящее время недоступен во многих эндемичных регионах. Учитывая высокие затраты на создание, экономически эффективное распространение MALDI-TOF потребует общего наращивания потенциала, включая его многочисленные применения в идентификации бактерий.