Ошибочный диагноз малярии в обычной системе здравоохранения в округе Арба-Минч на юго-западе Эфиопии: значение для борьбы с малярией и ее ликвидации | Журнал о малярии

Описание области исследования

Это исследование было проведено в медицинском центре Колла Шелле, район Арба Минч Зурия, зона Гамо, юго-западная Эфиопия. Арба-Минч-Таун является центром района. Есть Кебелес (самая нижняя административная единица) района. Десять находятся в низинах, а восемь — в средних землях. Колла Шелле – один из Кебелес где малярия эндемична. Центр здоровья Колла Шелле обслуживает шесть человек. Кебелес в водосборе. Он также поддерживает 11 медицинских пунктов в пределах бассейна, обслуживающих около 47 970 жителей. Анофелес арабский является основным переносчиком малярии, тогда как Анофелес фароенсис играет второстепенную роль [10, 11].

Дизайн исследования, популяция исследования и размер выборки

Поперечное исследование на базе медицинских учреждений проводилось с ноября 2019 года по январь 2020 года. В исследуемую популяцию вошли лица с подозрением (с лихорадкой, головными болями и другими признаками и симптомами малярии) в возрасте пяти лет и старше, посетившие исследовательский медицинский центр по диагностике и лечению малярии в течение периода исследования. Были включены как последовательные положительные случаи, так и подвыборка микроскопически отрицательных случаев. Это исследование было направлено на сравнение вложенной nPCR с микроскопией, чтобы определить процент случаев малярии, которые были неправильно диагностированы или упущены из виду при микроскопии. Таким образом, размер выборки, включенный в эту ограниченную по времени структуру выборки, считался адекватным для исследования.

Сбор образцов крови и идентификация видов

Лабораторные технологи, работающие в санатории, собирали венозную кровь после получения согласия участников исследования и/или опекунов. Один миллилитр венозной крови собирали одноразовым стерильным шприцем и переносили в пробирку, содержащую цитрат натрия. Сразу около 2 мкл крови использовали для приготовления тонкого и толщиной 6 мкл мазка крови. После высыхания на воздухе тонкого мазка сначала его фиксировали метанолом, а после высыхания на воздухе толстого слоя крови предметное стекло окрашивали 10% раствором Гимзы в течение примерно 10 мин. В конце предметное стекло промывали чистой водой и сушили на воздухе. Лаборанты-технологи центра первичной медико-санитарной помощи исследовали слайды в рамках регулярного оказания медицинских услуг. Проверили на наличие или отсутствие паразитов. После исследования 200 лейкоцитов и отсутствия каких-либо паразитов препарат был признан отрицательным. Никакой специальной подготовки технологов не проводилось, и во время исследования не применялось никаких конкретных мер по обеспечению качества.

В положительных случаях лечение проводилось в соответствии с национальными рекомендациями по лечению малярии, если у пациента был положительный результат микроскопии. На каждой фильтровальной бумаге Whatmann™ 3MM (VWR®) готовили по три пятна. Около 20 мкл в каждом пятне и всего 60 мкл образца крови наносили на одну фильтровальную бумагу Whatmann™ 3MM (VWR®) для проверки с помощью вложенной nPCR. Кровь на фильтровальной бумаге сушили на воздухе с получением сухих пятен крови (DBS). Высушенный DBS помещали в пластиковый пакет с застежкой-молнией и силикагелем. Затем его доставили в Лабораторию передовой медицинской энтомологии и борьбы с переносчиками инфекции Университета Арба Минч для молекулярного анализа.

Плазмодий выявление паразитов методом вложенной ПЦР

Экстракция ДНК из DBS

Экстракцию ДНК из DBS проводили с использованием метода экстракции сапонина/хелекса. [12]. Вкратце, 6 мм DBS обрабатывали сапонином в фосфатно-солевом буферном растворе в течение ночи при 4 ° C на планшетном шейкере. Последний элюат проводили в 80 мкл. ДНК хранили при температуре -80°С до дальнейшего использования.

Идентификация малярийных паразитов

Плазмодий Идентификацию вида проводили с помощью 18S рРНК-нПЦР по протоколу Snounou et al.. [13]. Короче говоря, для каждой реакции использовались родоспецифичные праймеры для прямой и обратной реакций. Для реакции амплификации N-1 при 1200 парах оснований было установлено условие циклирования. После завершения ПЦР-амплификации n-1 проводят реакцию ПЦР n-2, П. фальципарум и П. вивакс Использовались видоспецифичные праймеры. Как положительные, так и отрицательные контроли анализировали вместе с образцами в термоциклере с использованием термоциклера BIO RAD 100™ (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). В конце второй ПЦР-амплификации готовили агарозный гель (Thermo Fisher Scientific Inc.). Амплифицированные продукты подвергали гель-электрофорезам. Для окрашивания использовался гель-красный. Амплифицированные продукты визуализировали в виде полос под четким обзором УФ-трансиллюминатора, а результаты записывали с использованием micro doc cs Scientific Ldt gel-doc. Наличие полосы 205 п.н. рассматривалось как положительный результат на образец. П. фальципарум полосу 120 п.н. считали пробой положительной на П. вивакс.

Организация и анализ данных

Данные, собранные из анкет и результатов лабораторных исследований, были введены в Microsoft Excel и проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS версии 20. Описательные данные были использованы для того, чтобы показать долю Плазмодий паразитов, обнаруженных с помощью микроскопии и nPCR, а также возраста, пола и температуры тела. Таблица непредвиденных обстоятельств 2 × 2 рассчитывала чувствительность, специфичность, а также положительные и отрицательные прогностические значения. Показатель Каппа (k) согласия между экспертами использовался для расчета согласия между микроскопией и nPCR.