Это проспективное исследование проводилось с июня 2021 года по июнь 2023 года в отделении неврологии Центральной больницы Тайюань и Шаньсийской сердечно-сосудистой и цереброваскулярной больницы, расположенных в провинции Шаньси. Исследование было одобрено комитетом по этике в 2021 году (№ 2021019) в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все участники предоставили письменное информированное согласие.
Общая информация
В исследование были включены пациенты в возрасте 18–80 лет с острым ишемическим заболеванием сосудов головного мозга в течение 4,5 часов от начала заболевания, как это определено в Европейских рекомендациях по диагностике и лечению острого ишемического инсульта 2018 года. Критериями исключения были кровоизлияние в мозг или субарахноидальное кровоизлияние, кардиогенная эмболия головного мозга, апоплексия головного мозга вследствие гематологических заболеваний, опухолей и т. д., серьезные осложнения, такие как заболевания печени, почек, кроветворения, эндокринной системы и остеоартрит, психические расстройства или тяжелая деменция, применение липидов. – препараты, снижающие и стабилизирующие бляшки, гормональные препараты и иммунодепрессанты в течение последних 3 месяцев, недавняя хроническая или активная инфекция и другие серьезные опасные для жизни заболевания с ожидаемым периодом выживания <3 месяцев. Была собрана информация о пациентах, включая возраст, пол, историю курения, историю употребления алкоголя, историю гипертонии, историю диабета, историю фибрилляции предсердий, а также лабораторные показатели при поступлении, такие как уровень глюкозы в крови, артериальное давление, общий холестерин, триглицериды (ТГ), вещества высокой плотности. холестерин липопротеинов (ЛПВП), холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), гомоцистеин (HCY) и миелопероксидаза (МПО). Дополнительно пациенты были разделены на четыре подгруппы в зависимости от времени начала инсульта: подгруппа 1 (0:00–05:59); подгруппа 2 (06:00–11:59); подгруппа 3 (12:00–17:59); и подгруппа 4 (18:00–23:59). Время забора крови во всех подгруппах находилось в пределах установленного срока.
Для контроля мешающих факторов в контрольную группу вошли лица с периферическим вестибулярным головокружением или шейным спондилезом, которые были сопоставимы по возрасту и полу с исследуемой группой. В контрольной группе не было симптомов или истории ишемического инсульта или других нейродегенеративных заболеваний, и она была протестирована с использованием того же метода обнаружения в тот же момент времени, что и исследуемые группы. Кроме того, у всех включенных в исследование пациентов ранее не было зарегистрировано нарушений сна или недавних путешествий через разные часовые пояса.
Оценка NIHSS
Оценка неврологического дефицита в исследуемой группе при поступлении оценивалась с использованием шкалы инсульта Национального института здоровья (NIHSS), причем оценки оценивались двумя квалифицированными специалистами, обученными ее использованию.
Обнаружение факторов окислительного стресса, включая малоновый диальдегид (MDA) и супероксиддисмутазу (SOD), воспалительных факторов, включая интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли-α (TNF-α), SIRT1 и BMAL1.
В ходе исследования первоначально у всех участников собирали 5 мл периферической венозной крови в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА перед любым клиническим вмешательством. Мононуклеарные клетки выделяли на ультрачистом рабочем столе в течение одного часа с использованием протокола, который включал добавление 1 объема свежей цельной крови к 3 объемам лизата эритроцитов с последующим центрифугированием при 450 × g в течение 10 минут при 4 ° C для осаждения лейкоцитов. Добавляли двойной объем лизата эритроцитов и смесь снова центрифугировали для получения осадка лейкоцитов. После удаления супернатанта изолированные клетки помещали в EP-пробирку емкостью 1,5 мл и хранили при -80°C до проведения ELISA и вестерн-блоттинга.
Уровни экспрессии факторов окислительного стресса (например, MDA и SOD) и факторов воспаления (например, IL-6 и TNF-α) измеряли с помощью ELISA.
Содержание MDA, SOD, IL-6 и TNF-α в образцах анализировали с использованием набора ИФА MDA человека, набора SOD ELISA человека, набора IL-6 человека ELISA и набора ELISA человека TNF-α конкурентным методом. Образцы добавляли в лунки, меченные ферментами, которые были предварительно покрыты антителами. Затем добавляли меченные биотином распознающие антигены и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Антиген и твердофазное антитело конкурировали за связывание, образуя иммунный комплекс. После промывки PBST для удаления несвязавшегося биотинового антигена добавляли авидин-HRP и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. После полного соединения авидина-HRP с биотиновым антигеном его промывали и добавляли окрашивающие растворы А и В. Смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин для проявления окраски. Наконец, реакцию останавливали добавлением стоп-раствора. Значение OD считывалось и рассчитывалось в течение 10 мин23.
Вестерн-блоттинг для определения уровней экспрессии SIRT1 и BMAL1.
Выделенные моноциты гомогенизировали жидким азотом, затем добавляли 1 мл PBS и центрифугировали при 500×g в течение 5 мин. Затем клетки ненадолго помещали в ледяную баню при максимальной мощности (3 × 10 с) и полученный супернатант собирали центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 15 мин при 4 °С. Концентрацию белка определяли с использованием метода количественного определения белка BCA и хранили при -20 °C для последующего использования. Проводили гель-электрофорез в ДСН-ПААГ и полученные белковые полосы переносили на ПВДФ-мембрану посредством трансфер-электрофореза. После блокировки мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре инкубацию первичного антитела проводили в течение ночи при 4 °С. Затем мембрану промывали 1 × TBST и инкубировали со вторичным антителом в течение 60 мин. После промывки мембраны для удаления свободных вторичных антител для визуализации результатов использовали набор ECL. Мембрану визуализировали с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Значение серого полосы баланса белого анализируется с помощью программного обеспечения ImageJ.
статистический анализ
Данные были проанализированы с использованием статистического программного обеспечения SPSS 25.0 и R 4.2.0. Для построения графиков использовали программное обеспечение Graph Pad Prism 8.0, а для анализа значений серого всех полос вестерн-блоттинга использовали программное обеспечение Image J2x. После проверки на нормальность данные измерений, которые соответствовали нормальному распределению, были выражены как «X-(среднее) ± S(SD)». Два независимых выборочных t-теста сравнивали средние значения между двумя группами. Данные асимметричного распределения были представлены как M(P25, P75) и сравнивались с использованием z-тестов. Для сравнения между несколькими группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с проведением теста на однородность дисперсии. Данные подсчета выражали в виде частот и процентов (n, %) и анализировали с использованием теста χ2. Корреляционный анализ между BMAL1, SIRT1, IL-6, TNF-α, MDA и SOD проводился с помощью корреляционного анализа Пирсона. Уровень теста был двусторонним α = 0,05, а P < 0,05 считался статистически значимым. Вестерн-блот-стрипы анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ 2 × для анализа значений серого.
Этическое одобрение
Исследование одобрено Комитетом по медицинской этике Центральной больницы Тайюань (номер одобрения: 2021019). Мы заверяем, что данное исследование строго соответствует принципам Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующих редакций. На протяжении всего процесса исследования мы следовали принципам медицинской этики и охотно соблюдали соответствующие национальные законы и правила. Мы уважаем автономию участников и придерживаемся принципов благодеяния, непричинения вреда и справедливости. Проект проводится согласно протоколу, утвержденному комитетом по этике, получено информированное согласие участников или их уполномоченных представителей. Для эффективной защиты прав и безопасности участников были реализованы комплексные процедуры информированного согласия.
2024-01-20 06:35:09
1705733375
#Роль #пути #SIRT1BMAL1 #регуляции #окислительного #стресса #на #ранних #стадиях #развития #ишемического #инсульта