Соединения и материалы
Все соединения и материалы представлены в дополнительной таблице S1.
Животные, вирус и инфекция
Мужские специфические мыши C57BL/6 весов C57BL/6 весом 20–25 г были приобретены в Laboratories Charles River. Все мыши жили при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), влажности (50 ± 20%) и освещении (6:30 – 6: 30 PM) в твердых нижних клетках с пищей и водой, доступной и либитум. Все эксперименты проводились с использованием одной и той же партии здоровых животных. Это исследование на животных было рандомизированным, плацебо-контролируемым и двойным слепым дизайном. И исследование животных было разработано для создания групп одинакового размера. Животные были исключены из анализа, если они были истощены или умерли в процессе нашего исследования.
В этом исследовании использовался вирус гриппа A/California/7/2009 (H1N1), полученный из американской коллекции культур типов. Смертельная доза вируса H1N1 была определена в экспериментах с инфекцией мыши. Вкратце, мышей (n = 10 на группу) анестезировали 2,5% изофлурана, а затем интраназально инфицировали 10-кратными серийными разведениями вируса. Смертность контролировалась в течение 15 дней после заражения. Средняя летальная доза (LD50) была рассчитана с использованием метода тростника. Мышей под анестезией интраназально индуцировали 50 мкл PBS, содержащего 0,8 × LD50 (8 × TCID50) вируса H1N1 в этом исследовании. Все эксперименты, связанные с живыми вирусами и живыми мышами, проводились в лаборатории Biosabetion Level 2 Plus (BSL-2+), следующие над государственными и институциональными руководящими принципами. Эксперименты на животных получили одобрение (202304454) от Комитета по уходу за животными и использованием медицинского университета Гуанчжоу и были выполнены в строгом соответствии с утвержденными руководящими принципами.
Учебный дизайн мышей
После двухнедельного периода акклиматизации мышей были случайным образом распределены в контрольную группу, группу H1N1 и группу циклоспорина А (циклоспорин А, 25 мг/кг). За исключением контрольных животных, все мыши получали единое интраназальное введение 0,8 × LD₅₀ (8 × TCID₅₀) вируса H1N1, растворенного в 50 мкл PBS под наркозом. Мышей в контрольной группе и группе H1N1 внутрибрюшинно вводили раствором транспортного средства (5% DMSO + 40% PEG300 + 5% TWEEN-80 + 50% воды, 0,2 мл), в то время как мыши в группе циклоспорина А вводили внутрибрюшинно с циклоспорином А, распущенного в растворе носителя. Управление лекарств началось в 1-й день после заражения и продолжалось в течение 8 дней подряд. Чувствительность кашля была оценена у всех экспериментальных мышей на 20-й день после инфекции. Ответы от кашля были выявлены путем выставки сознательных, безудержных мышей на аэрозолизированную 0,4 м лимонную кислоту в течение 10 минут в плетизмографии всего тела (Buxco, USA). События кашля были определены количественно путем одновременного анализа изменений давления и аудиозаписей. На 21-й день после заражения все мыши гуманно анестезировали через внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитального натрия (150 мг/кг). Кровь, бронхоалвеолярная лаважная жидкость (BALF), селезенка и ткани легких собирали и обрабатывали в соответствии с установленными протоколами [14]Полем Этот экспериментальный протокол также поставляется на рис. 1а.
Рис. 1
Влияние циклоспорина А на хроническое воспаление легочного легочного, вызванное вирусом H1N1 у мышей. (A) Экспериментальный протокол для мышей, которые обрабатывали вирусом H1N1 и циклоспорином A. Чувствительность кашля была обнаружена у всех мышей на 20 -й день. Все мыши приносили в жертву через 21 день после интраназального введения с помощью вируса H1N1 HIPPLENZA или PBS. Групповые данные, показывающие влияние вируса H1N1 и циклоспорина А на изменения массы тела мышей (B). *, P = 0,000, по сравнению с «контролем». #, P = 0,020, по сравнению с «H1N1». (C) Количество событий кашля в течение 10 минут после воздействия животных аэрозольной лимонной кислоте (0,4 м). n = 10 на группу на рис. 1B и C. суммировали данные, показывающие влияние вируса H1N1 и циклоспорина А на концентрацию мочевой кислоты (D) и количество клеток (E) в BALF. n = 10 в контрольной группе и группе H1N1 на рис. 1D и E, n = 9 в группе циклоспорина А на фиг. 1D и E. (FH) репрезентативные фигуры патологических изменений в срезах легких, окрашенных гематоксилином и эозином, из группы «контроль» (F), «H1N1» (G-g) и «циклоспорин A» (H). Символ «↑» отмечает проникновение лимфоцитов (красный) и нейтрофилов (синий). Масштабные стержни составляют 50 мкм для электронных микрофотографий. (I) суммировали данные, показывающие общие патологические оценки легких мышей (n = 10 на группу). Данные показаны как среднее значение ± SD на рисунке C, D и E. В противном случае данные показаны как медиана (IQR). Мышей в разных группах обрабатывали следующим образом: контрольная группа (в с помощью PBS + IP с раствором для транспортного средства), группа H1N1 (в дозе 0,8 × LD50 вируса H1N1 + IP с раствором носителя) и циклоспорина A (в дозе 0,8 × LD50 вируса H1N1 + IP -с 25 мг/кг циклфоропросфорин). Sac., Жертва; в, интраназально; IP, внутрибрюшинная; LD50, средняя смертельная доза
Скорость выживаемости и изменения веса тела
Выживаемость и вес тела в каждой группе регистрировались ежедневно в течение экспериментального периода. Благополучие животных оценивали ежедневно посредством мониторинга потери веса (> 30%), уровней активности (тяжелая летаргия или неспособность получить доступ к пище/воде), а также клинические признаки (сгорание, одышка), используя эти предопределенные гуманные конечные точки для обеспечения минимальных страданий. Мыши были безболезненными убитыми с передозировкой пентобарбитальной натрия при достижении предопределенных гуманных конечных точек.
Анализ BALF
Для коллекции BALF правое легкое (зарезервированное для других анализов) было выделено путем лигирования правого бронха. BALF собирали путем лаваки левого легкого трижды с солевым раствором 0,4 мл фосфата (PBS). После центрифугирования (800 × g, 5 мин, 4 ° C) супернатант собирали и хранили при – 80 ° C для последующего анализа. Лейкоциты в BALF определяли количественно с использованием гемоцитометра. Затем осадок смазали на стеклянные горки для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E). Дифференциальное количество клеток проводилось путем категоризации лейкоцитов на нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты и эозинофилы на каждом слайде. Концентрации мочевой кислоты в супернатанте BALF измеряли с использованием коммерческих наборов анализа после протокола производителя.
Вирусные титрование
Вирусные титры количественно определяли в гомогенатах ткани легких. Ткани легких гомогенизировали в буферированном солевом растворе TRIS (10 мкл/мг). Следовательно, гомогенаты ткани легких центрифугировали при 8000 × g в течение 10 минут при 4 ° C. Супернатант был собран для определения вирусного титра. Все вирусные запасы были распространены в клетках почек с собаками Мадина Дарби. 50% инфекционная доза тканевой культуры (TCID50) определяли посредством титрования серийного вируса в клетках почек с собаками Мадина Дарби, причем титры рассчитывали с использованием метода тростника, как описано ранее [15]Полем
Гистопатологический анализ легких мыши
Ткани легких фиксировали в 4% параформальдегиде и врученном парафином. Срезы легких мыши депарафинизировали в ксилоле и регидратировали посредством градуированного спирта, а затем окрашивание H & E для гистопатологической оценки. Гистологические изменения легких были оценены с точки зрения отека легких, инфильтрации воспалительных клеток, экстравазации эритроцитов и нарушения альвеолярной архитектуры. Гистологические изменения легких оценивали с использованием 4-точечной системы оценки: (0) нет, (1) мягкой, (2) умеренной и (3) тяжелой. Совокупность этих индивидуальных баллов обеспечила количественную меру общей патологии легких.
Иммуноферментный анализ, связанный с ферментом (ELISA)
Ткани легких гомогенизировали в буфере для лизиса ткани и центрифугировали при 12000 × g в течение 20 минут при 4 ° С. Полученный супернатант был собран для анализа ELISA. Концентрации IFN-γ количественно определяли с использованием коммерческих наборов ELISA после протокола производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием считывателя микропланшетов (Thermo Fisher, США).
Анализ проточной цитометрии мышиных мононуклеарных клеток из клеток крови, тканей легких и тканей селезенки
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), мононуклеарные клетки-резиденты легких (LRMC) и мононуклеарные клетки селезенки (SMC) выделяли из клеток крови, тканей легких и тканей селезенки, как описано ранее [7, 14, 16]Полем
После центрифугирования собранных PBMC, LRMC и SMC остаточные эритроциты в осадке удаляли с помощью буфера для лизиса эритроцитов. Извлеченные PBMC, LRMC и SMC были ресуспендированы в PBS и подвергались проточным цитометрическим анализу.
Для окрашивания клеток клетки сначала стимулировали Golgiplug. Впоследствии клетки инкубировали с блокированием мышиного FC-рецептора, смесью антител CD3, CD4, CD8, CXCR3 и CCR4 и внутриклеточного антитела IFN-γ. Проточная цитометрия проводили с использованием BD FACS VERSETM, и данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Flowjo (Treestar, Ashland, ORE). Стратегия стробирования была описана на дополнительном рисунке S1.
Статистический анализ
Нормальность данных оценивалась с использованием тестов Шапиро -Уилка и Колмогорова -Смирнова. Обычно распределенные данные были представлены в качестве среднего ± стандартное отклонение (SD), в то время как ненормальные данные были выражены как медиана (межквартильный диапазон, IQR). Для обычно распределенных данных одностороннее ANOVA с последующим множественным сравнительным тестами Бонферрони использовалась для групповых сравнений. Последующие тесты проводились только в том случае, если F достиг P <0,05, и не было значительной неоднородности. Нормально распределенные данные были проанализированы с использованием тестов Крускал-Уоллиса для нескольких групп или U-тестов Манн-Уитни для сравнений с двумя группами. Статистическая значимость была определена как двусторонняя p <0,05 для всех анализов.
2025-07-25 09:29:00
1753436867
#Циклоспорин #облегчает #хроническое #легочное #воспаление #гриппа #H1N1 #индуцированное #вирусом #путем #уменьшения #IFNγпродуцирующих #Тлимфоциты #Virology #Journal
Продолжение темы
