Антифиброзный эффект апремиласта на фибробластах дермы при системном склерозе и мышиной модели, индуцированной блеомицином

Реагенты

TGF-β1 был приобретен у PeproTech (Рокки Хилл, Нью-Джерси, США). Апремиласт был приобретен у AdooQ Bioscience (Ирвайн, Калифорния, США). Зонды TaqMan были приобретены у Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). В нашем эксперименте использовались следующие зонды TaqMan: Hs00164004_m1 (COL1A1), Hs00164099_m1 (COL1A2), Hs01026927_g1 (ЦТГФ), Hs00426835_g1 (АКТА2) и NM_002046.3 (ГАФДГ). Специфические пары праймеров для PDE4A – D были описаны в дополнительной таблице С1. Первичными антителами, использованными для вестерн-блоттинга, были антитела, специфичные к коллагену типа I (1310-01; Southern Biotech, Бирмингем, Алабама, США), фактору 2 сети клеточной связи (CCN2) (sc-14939; Санта-Крус, Санта-Крус, Калифорния, США), фосфо-AKT (4060; Cell Signaling Technologies, Дэнверс, Массачусетс, США), Akt (9272; Cell Signaling Technologies), phopho-Erk1/2 (4370; Cell Signaling Technologies), Erk1/2 (4695; Cell Signaling Technologies) Technologies), GAPDH (sc-25778; Санта-Крус), фосфо-Smad3 (9520; Cell Signaling Technologies) и Smad3 (9523; Cell Signaling Technologies). Первичными антителами, использованными для иммуногистохимии, были антитела, специфичные к альфа-актину гладких мышц (αSMA) (14968; Cell Signaling Technologies), CD3 (ab5690; Abcam, Кембридж, Великобритания) и F4/80 (ab111101; Abcam). Блеомицин был предоставлен компанией Nippon Kayaku Co., Ltd. (Токио, Япония).

Дермальные фибробласты

Дермальные фибробласты, полученные от здоровых взрослых, были приобретены у Lonza (Базель, Швейцария) и Kurabo (Осака, Япония). Дермальные фибробласты, полученные от пациентов с ССД, были получены из пораженных участков предплечий. Из-за отсутствия подробной информации о приобретенных дермальных фибробластах мы не смогли сопоставить дермальные фибробласты, полученные от здоровых людей и пациентов с ССД, по полу и возрасту. Диагноз ССД был поставлен на основании классификационных критериев Американского колледжа ревматологии/Европейской лиги против ревматизма 2013 года.¹⁷. Все пациенты имели диффузный кожный тип в течение пяти лет после появления феномена Рейно на момент проведения биопсии кожи и не получали глюкокортикоидного или иммуносупрессивного лечения. В этом исследовании использовали до пяти пассажей дермальных фибробластов как от здоровых людей, так и от пациентов с ССД. Фибробласты инкубировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и пенициллином/стрептомицином, при 37 °C в 5% CO.₂. Среду заменяли бессывороточной DMEM за 24 ч до всех экспериментов. Для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) фибробласты инкубировали с 1–10 мкМ апремиласта в присутствии или в отсутствие 10 нг/мл TGF-β1 в течение 48 часов. Для вестерн-блоттинга фибробласты инкубировали с 10 мкМ апремиласта в присутствии или в отсутствие 10 нг/мл TGF-β1 в течение 30 минут для оценки передачи сигнала и в противном случае в течение 72 часов.

Внутриклеточное измерение цАМФ

Внутриклеточные уровни цАМФ измеряли с использованием коммерчески доступного набора для иммуноферментного анализа (ИФА) (Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган, США), как описано ранее.¹⁸. Вкратце, за 30 минут до обработки клетки обрабатывали 3-изобутил-1-метилксантином для устранения эффектов эндогенной активности ФДЭ. Через тридцать минут после обработки собирали клеточные лизаты и проводили измерения в соответствии с инструкциями производителя.

Выделение РНК и количественная RT-PCR

Для анализа экспрессии мРНК в дермальных фибробластах общую РНК выделяли с использованием коммерчески доступного набора (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Равное количество тотальной РНК подвергали обратной транскрипции для синтеза кДНК. кДНК смешивали с мастер-миксом (Thermo Fisher Scientific) и каждый праймер наносили на планшет в трех экземплярах. Количественную ОТ-ПЦР проводили с использованием зондов TaqMan на системе ПЦР в реальном времени ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific). ГАФДГ служил внутренним контролем, и экспрессию каждой мРНК рассчитывали с использованием метода сравнительного CT (ΔΔCT). Выражение PDE4A – D мРНК определяли количественно с использованием системы SYBR. Для оценки PDE4A – D Для экспрессии ПЦР-амплифицированные продукты подвергали электрофорезу через агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, и визуализировали с помощью трансиллюминатора.

Вестерн-блоттинг

Культивированные дермальные фибробласты дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали на льду лизирующим буфером, дополненным ингибиторами протеазы. Концентрации белка рассчитывали с использованием набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (Thermo Fisher Scientific). Равные количества белка наносили на 4–20% трис-глициновый гель (Thermo Fisher Scientific) и разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Затем гели переносили на мембраны из поливинилиденфторида (ПВДФ). После блокировки 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали с первичными антителами при 4°C в течение ночи. Мембраны трижды промывали PBS и инкубировали со вторичными антителами. Сигналы визуализировали с помощью электрохимического раствора (Вако, Осака, Япония). Плотность полос рассчитывали с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).

Мыши

Мыши BALB/c были приобретены у Sankyo Labo Service Co., Ltd. (Токио, Япония). Протокол развития дермального фиброза, индуцированного блеомицином, у мышей был описан ранее.¹⁸. Вкратце, блеомицин растворяли в 1 мг/мл PBS и стерилизовали фильтрованием. Шестинедельным самкам мышей брили спину и вводили подкожно либо 300 мкл PBS, либо равное количество блеомицина. Инъекции повторяли пять раз в неделю в течение четырех недель. Апремиласт растворяли в PBS в дозе 1 мг/кг или 5 мг/кг и вводили внутрибрюшинно одновременно с инъекцией блеомицина в группе лечения апремиластом. После завершения протокола мышей умерщвляли в соответствии с руководящими принципами Комитета по этической экспертизе экспериментов на животных Токийского женского медицинского университета и разрезали кожу на спине. Образцы кожи фиксировали в 10% формальдегиде и заливали в парафин.

Гистологическая оценка

Внедренную ткань делали срезы толщиной 3 мкм (MBL, Токио, Япония; Sept Sapie, Токио, Япония). Для оценки толщины дермы слайды окрашивали трихромным красителем Массона (MBL, Токио, Япония; Sept Sapie, Токио, Япония). Измеряли расстояние от эпидермо-дермального соединения до дермо-жирового соединения. Изображения окрашенных предметных стекол сканировали и с помощью программного обеспечения ImageJ рассчитывали среднюю толщину дермы в пяти случайно выбранных полях при одинаковом увеличении. Слайды были слепыми при измерении толщины дермы.

Иммуногистохимия

Для иммуногистохимического анализа срезы депарафинизировали и инкубировали с 3% перекисью водорода после извлечения антигена и блокировали 5% раствором обезжиренного молока. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 °С, а затем со вторичными антителами в течение 1 часа. В качестве первичных использованных антител были анти-αSMA (1:200), CD3 (1:50) и F4/80 (1:200). Антитела визуализировали с помощью системы DAKO EnVision (DAKO, Санта-Клара, Калифорния, США). Срезы обрабатывали дигидратом 3,3′-диаминобензидина тетрагидрохлорида и докрашивали гематоксилином. Срезы фотографировали при 100-кратном увеличении. Количество положительно окрашенных клеток на трех изображениях кожи подсчитывали для каждой группы мышей слепым способом. Для статистического анализа использовали усредненное количество положительных клеток.

Содержание коллагена

Мы собрали образцы кожи у мышей с помощью биопсийного инструмента диаметром 6 мм (KAI Industries, Гифу, Япония) и провели количественную оценку образцов с помощью набора для анализа общего коллагена QuickZyme (QuickZyme Biosciences, Лейден, Нидерланды), следуя инструкциям производителя.

статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Манн-Уитни ты тест использовался для сравнения двух групп. Для сравнения нескольких групп использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки. Данные анализировали с использованием статистического программного обеспечения JMP (японская версия 16, SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). p<0,05 считалось статистически значимым.

Одобрение этики

Это исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и соответствующими руководящими принципами и правилами. Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Токийского женского медицинского университета (№ 3097-Р). Все участники были проинформированы о содержании этого исследования, и было получено письменное информированное согласие. Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по этической экспертизе экспериментов на животных Токийского женского медицинского университета (AE21-136) и проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.