Венулы с высоким эндотелием предсказывают ответ на ингибиторы PD-1 в сочетании с антиангиогенезной терапией при НМРЛ

Исследование в этой статье состоит из двух частей: ретроспективного клинического исследования и фундаментального исследования, которые в основном разделены на экспериментальные этапы с использованием дополнительных материалов. Подробности смотрите в тексте ниже.

Анализ реальных данных

Исследуемая популяция

Были собраны пациенты с НМРЛ на поздних стадиях, поступившие в онкологический центр больницы Жэньминь Уханьского университета с декабря 2019 года по январь 2021 года. Включенные пациенты соответствовали следующим критериям включения и исключения: (1) гистопатологически подтвержденный диагноз НМРЛ; (2) стадии TNM IIIB—IV; (3) схема лечения должна включать ингибиторы программируемой клеточной гибели 1 (PD-1) с антиангиогенными препаратами или без них; (4) все пациенты получают не менее двух курсов комбинированной терапии (курс 21 день). Наблюдение за пациентами осуществлялось по телефону или амбулаторно, последнее наблюдение состоялось в июле 2021 года. Все собранные выше клинические данные были ретроспективными.

Переменная исследования

Были оценены частота объективного ответа (ЧОО), уровень контроля заболевания (DCR), выживаемость без прогрессирования (ВБП) и безопасность.

ВБП определяется как время от приема ИКИ в сочетании с антиангиогенезом или без него до прогрессирования заболевания или смерти пациента. Общие терминологические критерии нежелательных явлений (CTCAE), версия 5.0¹¹ использовался для оценки нежелательных явлений (НЯ) пациентов. Уровень экспрессии лиганда запрограммированной гибели клеток 1 (PD-L1) опухолевых клеток оценивали с использованием показателя доли опухоли (TPS).

Множественное иммунофлуоресцентное окрашивание

Образцы пациентов

В общей сложности 14 патологических срезов пациентов в группе лечения до лечения были собраны в патологическом центре больницы Жэньминь Уханьского университета. Все пациенты предоставили информированное согласие на взятие образцов их тканей. Фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) блоки были извлечены и взяты предметные стекла толщиной 4 мкм для множественного иммунофлуоресцентного окрашивания.¹². Затем срезы были разделены на эффективную группу (ВБП > 6 месяцев) и недействительную группу (ВБП ≤ 6 месяцев) в соответствии с ВБП. Кроме того, мы собрали патологические срезы до лечения у 42 пациентов с НМРЛ, которые получали последующую иммунотерапию с антиангиогенезной терапией или без нее.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике больницы Жэньминь Уханьского университета, номер этики: WDRY2022-K041.

Мультиплексная иммунофюоресценция

Фиксированные формалином и залитые в парафин образцы первичных опухолей подвергали иммуноокрашиванию с использованием реагентов Opal™. Влияние различных концентраций и количеств реагентов анализировали с точки зрения специфичности сигнала, эффективности удаления, эффектов порядка окрашивания и выделения спектрального сигнала. Изображения были получены с помощью автоматизированной системы визуализации Vectra 3.0® или Vectra Polaris и проанализированы с помощью программного обеспечения inForm®.¹².

Анализ изображений

Флуоресцентные слайды сканировали с помощью Vectra Polaris 3.0 (Akoya Biosciences, Мальборо, Массачусетс, США) с использованием 40-кратного увеличения (Plan APO 40 × /NA 0,75, 0,25 мкм/пиксель) и автоматического определения времени экспозиции. Скан всего предметного стекла визуализировали с использованием 5 эпифлуоресцентных фильтров (DAPI, Opal 480, Cy3, Cy5 и Opal 780). Отдельные ядра ТМА были выбраны с использованием массива ТМА в программном обеспечении Phenochart для получения изображений и получены с автоматически рассчитанным временем экспозиции для каждого эпифлуоресцентного фильтра. Полный протокол сбора данных Opal 9 требует использования 7 эпифлуоресцентных фильтров (DAPI, Opal 480, FITC, Cy3, Texas Red, Cy5 и Opal 780) для визуализации в спектральных диапазонах 20 нм, как это разработано для Vectra Polaris. Мультиплексные автофюоресцентные слайды без первичных антител создавали и сканировали с использованием того же времени экспозиции, что и маркированные мультиплексные слайды. Затем мы получили изображение на Akoya Vectra Polaris и выполнили мультиспектральное несведение с помощью INFORM.^13,14.

секвенирование РНК

Группа пациентов и сбор образцов

Всего было отобрано 14 пациентов, получавших иммунотерапию в сочетании с антиангиогенной терапией, затем эти пациенты были разделены на эффективную группу (ВБП > 6 мес, n = 7) и группу отсутствия (ВБП ≤ 6 мес, n = 7) по ВБП. Соберите образцы крови этих пациентов перед лечением, извлеките РНК из лейкоцитов после экстракции периферической крови, выполните секвенирование РНК.

Обработка данных RNA-seq и проверка качества

Файлы RNA-seq FASTQ сначала обрабатывались с помощью FastQC (v.0.11.5)45, инструмента контроля качества для оценки качества считываний секвенирования как на базовом уровне, так и на уровне считывания. Считывания, которые имели ≥ 15 смежных оснований низкого качества (оценка Phred <20), были удалены из файлов FASTQ. Затем было выполнено двухпроходное выравнивание STAR (v.2.5.3)46 на отфильтрованных файлах FASTQ с параметрами по умолчанию для создания файла BAM RNA-seq для каждого события секвенирования. После этого RNA-SeQC (v.1.1.8)47 был запущен на согласованных файлах BAM для создания ряда показателей контроля качества, связанных с RNA-seq, включая количество чтений, покрытие и корреляцию. Впоследствии с помощью RNASeQC была создана матрица коэффициентов корреляции Спирмена среди всех событий секвенирования. Корреляционная матрица была тщательно проверена, и событие секвенирования было получено из одного пула библиотек.^13,15.

Деконволюция клеточного состава с помощью MCP-счетчика

Программное обеспечение пакета R MCP-counter18 было применено к нормализованной log2-трансформированной матрице экспрессии FPKM для получения показателей абсолютной численности основных типов иммунных клеток CD3+ T-клеток, CD8+ T-клеток, цитотоксических лимфоцитов, естественных клеток-киллеров, B-лимфоцитов, моноцитарных клеток линии. и миелоидные дендритные клетки¹². Затем профили деконволюции были иерархически сгруппированы и сравнены между группами ответа и лечения.¹³.

Генные сигнатуры функциональной ориентации

Подписи были следующие^16,17. Т-клетки: CD28, CD3D, CD3G, CD5, CD6, CHRM3-AS2, CTLA4, FLT3LG, ICOS, MAL, PBX4, SIRPG, THEMIS, TNFRSF25 и TRAT1; CD8+ Т-клетки: CD8B, цитотоксические лимфоциты: CD8A, EOMES, FGFBP2, GNLY, KLRC3, KLRC4 и KLRD1; линия B: BANK1, CD19, CD22, CD79A, CR2, FCRL2, IGKC, MS4A1 и PAX5; Моноцитарная линия: ADAP2, CSF1R, FPR3, KYNU, PLA2G7, RASSF4 и TFEC; Миелоидные дендритные клетки: CD1A, CD1B, CD1E, CLEC10A, CLIC2 и WFDC21P; Активация Т-клеток (CXCL9, CXCL10, CXCL16, IFNG и IL15), выживаемость Т-клеток (CD70 и CD27)^13,18.

статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием R версии 3.3.3. Критерий хи-квадрат Пирсона или точный критерий Фишера (когда в таблице непредвиденных обстоятельств менее 5 ожидаемых значений) используется для анализа взаимосвязи между ответом на лечение и клиническими характеристиками, а также наличия существенных различий в исходных характеристиках между группой лечения и контрольная группа. Метод Каплана-Мейера использовался для анализа ВБП, а лог-ранговый тест — для сравнения различий в результатах выживаемости между различными группами. Затем мы использовали многомерную регрессию Кокса для анализа прогностической ценности каждого клинического фактора для пациентов с ВБП. P <0,05 считалось статистически значимым.

Одобрение этики и согласие на участие

Это исследование было одобрено Комитетом по этике больницы Жэньминь Уханьского университета, номер этики: WDRY2022-K041. Все методы выполнялись в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.