Замена аргинина 219 глицином нарушает стабильность, димеризацию и каталитическую активность у мутанта G6PD.

Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) является одной из наиболее распространенных ферментопатий у человека, встречается примерно у полумиллиарда человек во всем мире, с преобладанием в странах Африки к югу от Сахары, на Аравийском полуострове и в Южной Азии, где он вызывает преимущество выживания для Плазмодий фальципарум инфекции¹. G6PD защищает эритроциты от окислительного повреждения, создавая восстановленную форму никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) через пентозофосфатный путь. Поэтому G6PD, являясь единственным клеточным источником НАДФН в эритроцитах, имеет решающее значение для поддержания соответствующего уровня глутатиона, тем самым защищая от окислительного повреждения и предотвращая гемолитическую анемию.

Дефицит G6PD является Х-сцепленным генетическим заболеванием. Ген расположен на Xq28, хорошо известной «горячей точке» в теломерной области q-плеча Х-хромосомы. Хотя гомозиготность у женщин встречается редко, гетерозиготность связана с вариабельным фенотипом из-за Х-инактивации. У мужчин есть только одна копия гена. На сегодняшний день зарегистрировано более 230 клинически значимых мутаций G6PD.¹.

Классификация вариантов, созданная в 1971 г. и действующая до 2022 г., делит варианты G6PD на пять классов, первые три из которых являются патогенными.^2,3. Варианты класса I — это те, которые наблюдаются при хронической несфероцитарной гемолитической анемии (CNSHA) в отсутствие инфекций, окислительных препаратов или приема конских бобов. Варианты классов II и III имеют остаточную активность менее 10% и от 10 до 60% соответственно. Нормальная активность наблюдается у вариантов класса IV, тогда как варианты класса V демонстрируют повышенную активность. Всемирная организация здравоохранения обновила эту классификацию в 2022 году, и теперь она включает следующие четыре класса, активность и фенотип которых указаны в скобках: A (активность <20%; CNSHA), B (активность <45%; острая триггерная анемия), C (активность 60–150%; гемолиз отсутствует) и U (неопределенная клиническая значимость, независимо от активности)⁴.

Настоящим мы описываем вариант G6PD у 15-летнего мужчины, известного дефицитом G6PD с неопределяемой активностью, что, следовательно, соответствует варианту CNSHA класса A (ранее класса I). Кроме того, мы предоставляем структурные, биофизические и биохимические доказательства молекулярной основы его патогенности.

У пациента была хроническая гемолитическая анемия, и в 14 лет у него случился эпизод гемолиза на фоне вирусной инфекции гриппа А. Его основные симптомы включали усталость, потерю веса и аппетита. При лабораторном обследовании наблюдались гемолиз, панцитопения и воспалительный синдром. Уровни общего и конъюгированного билирубина составляли 46,5 мкмоль/л и 18,3 мкмоль/л (N 0–10, 0–5,2) и улучшились через 2 недели (общий билирубин 19 мкмоль/л). Через шесть месяцев после разрешения вирусного эпизода сохранялась макроцитарная анемия с гемоглобином 120 г/л (N 130–160), средним корпускулярным объемом эритроцитов 103,7 фл (N 78–98), ретикулоцитами 41,4 ‰ (N 5–98). 15). УЗИ брюшной полости без особенностей. Интересно, что первоначальная активность G6PD, измеренная во внешней лаборатории, показала активность от 15 до 20%; последующая дозировка в национальной справочной лаборатории (Цюрих, Швейцария) не показала нулевую активность. Результат последнего измерения затем сохранялся с клиническим диагнозом дефицита G6PD класса А. В этот момент нашу команду медицинской генетики попросили провести молекулярную диагностику, чтобы подтвердить патогенность варианта, учитывая противоречивые данные об активности из двух лабораторий.

У матери пациента был ретикулоцитоз и макроцитоз; а его бабушка по материнской линии была известна ретикулоцитозом и макроцитарной анемией. Его дядя по материнской линии был известен дефицитом G6PD, что было подтверждено измерением ферментативной активности без проведения генетического тестирования. И у матери, и у дяди была неонатальная желтуха, которая, что интересно, в случае его матери была более тяжелой. Остальная часть семейного анамнеза не имела никакого значения.

Установлено, что у пациента в гемизиготном состоянии имеется миссенс-вариант Г6ПД ген (NM_000402):c.745 A > G:p.(Arg249Gly) в экзоне 7, что соответствует замене аминокислоты аргинин на глицин в положении 219 в каноническом транскрипте (замена основания A655G). Анализ сегрегации показал, что он унаследовал этот вариант от своей матери, что соответствует Х-сцепленному рецессивному типу наследования. Этот вариант также был обнаружен у его дяди по материнской линии и бабушки по материнской линии. Дядя оказался гемизиготным, а мать и бабушка гетерозиготными, как и ожидалось.

Этот вариант отсутствовал в базе данных агрегации генома и публичных архивах, в которых сообщается о научно обоснованных связях между вариациями и фенотипами человека, а именно в базе данных мутаций генов человека, Лейденской открытой базе данных вариаций и ClinVar, базе данных, размещенной Национальным центром биотехнологической информации. Аминокислотное изменение было предсказано как патогенное всеми использованными алгоритмами (SIFT, PolyPhen, MutationTaster и CADD).

Тот же вариант, названный G6PD Meyer, был упомянут в недавнем обзоре G6PD, но никогда не описывался в оригинальной публикации.³. Поэтому в настоящем исследовании мы попытались подробно охарактеризовать его на молекулярном уровне. Мы очистили экспрессируемый бактериями белок и провели спектроскопию кругового дихроизма, чтобы изучить сохранение вторичной структуры. Биохимическая характеристика была проведена, чтобы определить, как мутация влияет на каталитическую активность фермента. Затем мы провели анализы термостабильности, а также анализы чувствительности к химической денатурации и расщеплению трипсином. Наконец, мы провели эксклюзионную хроматографию, чтобы изучить влияние мутации на олигомерное состояние.