Карта эпитопов человеческих антител антигена вакцины против малярии Pfs25

Заявление об этике человека

Это исследование было одобрено экспертными советами по этике Фармацевтического и стоматологического факультета (FMPOS), Бамако, Мали, и Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США (NIH, Бетесда, Мэриленд, США). а также национальным регулирующим органом Мали и проводилось в соответствии с FDA IND 17130. Участники дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Клиническое исследование NCT02942277 было зарегистрировано на сайте ClinicalTrials.gov и будет опубликовано в другом месте.

Состав антигена и иммунизация

NCT02942277 было первым испытанием Pfs25-EPA и Pfs230D1-EPA с AS01 на людях для определения безопасности, иммуногенности и функциональной активности этих вакцин у взрослых малийцев. Партии PpPfs25 и EcEPA, а также вакцина с конъюгированными наночастицами Pfs25-EPA были изготовлены на заводе Walter Reed Bioproduction (Сильвер-Спринг, Мэриленд) в соответствии с требованиями cGMP. PpPfs25 представляет собой экспрессируемый Pichia рекомбинантный Pfs25 с молекулярной массой 18 713 дальтон. Вакцина Pfs25-EPA была упакована во флаконы в виде конъюгированного Pfs25 в 4 мМ PBS до 2-кратного разведения высокой дозы (188 мкг/мл в объеме 0,5 мл) в соответствии с GMP на предприятии Walter Reed Bio-production в апреле 2016 г. использовать флакон. Адъювант AS01B был предоставлен компанией GSK в виде одноразового флакона, содержащего 100 мкг/мл MPL и 100 мкг/мл QS21 в липосомальном составе в объеме 0,625 мл. Одна доза AS01, введенная в этом исследовании, соответствовала 50 мкг QS21 и 50 мкг MPL.

В исследовании сначала участвовала экспериментальная когорта взрослых с возрастающей дозой, контролируемая препаратами сравнения.Н = 65) в пригородном сообществе в Мали для оценки безопасности и иммуногенности Pfs25 (16 мкг, Н = 5; 47 мкг, Н= 10), Pfs230D1 (13 вг, Н= 5; 40 мкг, Н= 10), или комбинация Pfs25 и Pfs230D1 (16 мкг + 13 мкг, Н= 5; 47 мкг + 40 мкг, Н= 10) по сравнению с компаратором (Engerix-B, Н= 20) вводили в 0, 1, 6 мес. hmAb Pfs25, используемые в этом исследовании, были получены от четырех субъектов в открытых когортах безопасности, которые получили 47 мкг Pfs25-EPA/AS01 (дополнительная таблица 1). Субъектами, включенными в клиническое исследование, были здоровые небеременные взрослые в возрасте 18–50 лет, которые на протяжении всей жизни подвергались воздействию сезонных П. фальципаруминфекционное заболевание. РВМС, использованные в этом исследовании, собирали через семь дней после третьей иммунизации.

Выделение и секвенирование mAb Pfs25

Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи определяли путем секвенирования Pfs25-специфичных одиночных В-клеток.⁵⁵. Эти клетки были отсортированы с использованием проточной цитометрии после обогащения биотинилированными зондами Pfs25. Для этого РВМС человека взрослых малийцев окрашивали CD3- (UCHT1), CD14- (M5E2), CD56- (HCD56) Alexa Fluor 700–, CD19 APC-CY7– (HIB19) и CD20 PE-CY7–конъюгированных ( 2H7) mAb, приобретенные у BioLegend. Стратегия гейтирования была применена сначала для дискриминации дублетов, затем были выбраны синглетные клетки для исключения не-В-клеток с использованием маркеров CD3, CD14 и CD56 (дополнительная рис. 7)⁵⁵. Лимфоциты были отобраны для CD19+CD20+. В-клетки, специфичные для Pfs25, гейтировали с использованием PE и исключая неспецифическое связывание с флуорохромом, используемым в тетрамере-ловушке BSA (CF594). Анализ проводили в FACSAria II (BD Biosciences) с использованием синего, красного и фиолетового лазеров. Pfs25-специфические В-клетки анализировали в соответствии с профилем флуоресцентного окрашивания и сортировали непосредственно в 96-луночный планшет с использованием FACS с соплом 100 мкМ. Затем планшеты центрифугировали при 1278 x g в течение 30 с и помещали при -80 °C. Амплификацию IG тяжелых вариабельных (VH) и легких вариабельных (VL) доменов из отдельных отсортированных клеток выполняла компания iRepertoire Inc. Вкратце, RT-PCR1 выполняли с вложенными мультиплексными праймерами, охватывающими тяжелые, κ и λ локусы и включающими частично Illumina адаптеры. Всего из каждой отдельной В-клетки амплифицировали фрагменты длиной 500 п.н., соответствующие доменам VH и VL.

СМФА

Культуры гаметоцитов штамма P. falciparum NF54 поддерживали в течение 16–18 дней при ежедневной смене среды. В день кормления микроскопией определяли гаметоцитемию и культуру доводили до 0,15–0,2% стадии гаметоцитемии V при гематокрите 50%. Культуру гаметоцитов (200 мкл) смешивали с тестируемым hmAb в указанной концентрации (в 60 мкл 1xPBS) и затем немедленно скармливали ~50 самкам в возрасте 3–6 дней. Анофелес стефенсикомаров через мембранный питающий аппарат. Комаров выдерживали восемь дней и препарировали (н= 20 на группу) для подсчета ооцист в средней кишке комаров с любыми яйцами в яичниках на момент вскрытия⁵⁶.

% ингибирования плотности ооцист (%TRA), 95% доверительный интервал (95% ДИ) и п– стоимость одного или нескольких каналов была рассчитана с использованием отрицательной биномиальной модели с нулевым завышением (ZINB), как и раньше.⁵⁷ с использованием R (версия 4.1.2, The R Foundation for Statistical Computing)⁵⁸.

Экспрессия и очистка Pfs25, scFv и IgG

Аминокислотная последовательность конструкции Pfs25, используемой для структурных и биофизических исследований, была получена от UniProt (P13829) и состояла из остатков K23-T193. Три сайта N-связанного гликозилирования в остатках 91, 143 и 165 внутри конструкции были заменены с Asn на Gln (дополнительная фиг. 2). Эту конструкцию клонировали в плазмиду pHLsec с гексагистидиновой меткой на С-конце.

Одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) были сконструированы путем слияния VH-области каждого mAb с парной VL-областью с помощью (GGGGS)₄ компоновщик. Все конструкции scFv также клонировали в плазмиду pHLsec с гексагистидиновой меткой на С-конце. Пятнадцать hmAb, использованных для начального скрининга, были экспрессированы в скелете IgG1 компанией LakePharma Inc. Пять hmAb, использованных для дальнейшей характеристики, были экспрессированы в виде IgG путем клонирования областей VH и VL в плазмиды pHLsec, содержащие тяжелые, IgG1κ или IgG1λ константные области человеческого IgG1.

Все конструкции временно экспрессировали в клетках Expi293 в соответствии с протоколом производителя (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Плазмиды легкой и тяжелой цепей котрансфицировали в соотношении 1:1. Все конструкции экспрессировали в виде секретируемого белка и собирали через четыре-пять дней после трансфекции. После центрифугирования Pfs25 и scFv очищали, загружая супернатант на смолу Ni-Sepharose Excel (Cytiva, Мальборо, Массачусетс) и промывая 10 колоночными объемами (CV) промывочного буфера (25 мМ Трис, рН 7,4, 300 мМ NaCl, 30 мМ). имидазол). Рекомбинантный белок элюировали пятью CV элюирующего буфера (25 мМ Трис, pH 7,4, 300 мМ NaCl, 150 мМ имидазол) и концентрировали с использованием ультрацентробежного фильтра Amicon с MWCO 10 кДа (Millipore Sigma, Burlington, MA). Концентрированный элюат очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 75 Увеличить 10/300 GL (Cytiva, Мальборо, Массачусетс), уравновешенной 20 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl.

IgG очищали путем разбавления супернатанта 1:1 в буфере для связывания IgG (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), наносили на смолу с белком А, промывали 10 CV буфера для связывания IgG (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) и элюировали. с 15 CV элюирующего буфера IgG. Элюат нейтрализовали, используя 100 мкл 1 М Трис, рН 9,0, на мл элюата, а затем концентрировали, используя ультрацентробежный фильтр Amicon с MWCO 50 кДа (Millipore Sigma, Burlington, MA). Элюат дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (Cytiva, Мальборо, Массачусетс), уравновешенной 20 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl.

BLI – Биннинг эпитопов

Все эксперименты BLI проводились с использованием OctetRED 96 (Sartorius, Fremont, CA) при 25 °C. Pfs25 был биотинилирован in vivo по С-концу Avi-Tag в клетках Expi293 путем совместной трансфекции с BirA в соотношении 9:1. Среда содержала биотин в концентрации 100 мкМ. После очистки Pfs25 и все scFv были заменены на буфер HBS-EP+ (Cytiva, Marlborough, MA) с использованием колонок Zeba Microspin Desalting с MWCO 7 кДа (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Затем Pfs25 разбавляли до 10 нМ, а все scFv разбавляли до 150 нМ в буфере HBS-EP+.

Биотинилированный Pfs25 наносили на стрептавидиновые биосенсоры (Sartorius, Fremont, CA) на 300 с, а исходное измерение получали на 60 с. Затем загруженные сенсоры погружали в лунки, содержащие насыщающий scFv (150 нМ), на 600 с. Был получен второй базовый уровень 60 с, а затем датчики погружали в лунки, содержащие конкурирующий scFv (75 нМ), на 300 с. Было замечено, что AS01-08 и AS01-50 имеют высокие уровни отклонения от сенсора, покрытого Pfs25, в течение исходного уровня и были исключены из эксперимента в качестве первичных scFv, но все еще подходили для использования в качестве конкурирующих scFv. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Octet Data Analysis HT 12.0 (Sartorius, Fremont, CA) и нормализовали по связыванию насыщающего антитела в отсутствие конкурирующего антитела с Pfs25 и с использованием самовычитания.

BLI – кинетика связывания

Эксперименты по кинетике связывания проводили с использованием IgG, разбавленного до 5 нМ в буфере HBS-EP+ (Cytiva, Marlborough, MA), и Pfs25, буфер которого был заменен на буфер HBS-EP+ с использованием колонок Zeba Microspin Desalting (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Каждый IgG загружали в биосенсоры Anti-Human Fc Capture (Sartorius, Fremont, CA) на 300 с для AS01-04, 600 с для AS01-50 и 360 с для AS01-63, прежде чем был получен базовый уровень 60 с. Затем датчик погружали в серию двукратных разведений Pfs25 с начальной концентрацией 75 нМ для AS01-04, 600 нМ для AS01-50 и 500 нМ для AS01-63, а затем погружали в лунку, содержащую только буфер, для измерять диссоциацию. Оба шага длились 300 с. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Octet Data Analysis HT 12.0 (Sartorius, Fremont, CA) и в целом соответствовали модели связывания 1:1. Для каждого IgG проводили три биологических повтора с тремя техническими повторами.

Комплексообразование, кристаллизация и определение структуры

Для образования каждого комплекса scFv Pfs25 и каждый scFv смешивали в молярном соотношении 1:1 и инкубировали на льду в течение 30 минут. Смесь концентрировали с использованием ультрацентробежного фильтра Amicon с MWCO 10 кДа (Millipore Sigma, Burlington, MA) и вводили в колонку Superdex 75 Увеличить 10/300 GL (Cytiva, Marlborough, MA), уравновешенную 20 мМ Tris, pH 8,0, 100. мМ NaCl. Фракции объединяли и концентрировали до 10–20 мг/мл перед использованием в экспериментах по кристаллизации.

Каждый белковый раствор смешивали в соотношении 1:1 с маточным раствором и использовали для постановки экспериментов по кристаллизации при 18°С. Кристаллы Pfs25 в комплексе с AS01-04 выращивали в 0,2 М растворе тиоцианата калия и 23% ПЭГ 3350 методом диффузии паров висячих капель и подвергали криозащите в 30% МПД. Кристаллы Pfs25 в комплексе с AS01-50 выращивали в 0,1 М хлориде лития, 0,1 М HEPES pH 7,5 и 25% ПЭГ 6000 методом диффузии паров висячей капли и подвергали криозащите в 30% ПЭГ 400 перед мгновенным замораживанием в жидком азоте. Кристаллы Pfs25 в комплексе с AS01-63 выращивали в 2,2 М сульфате аммония и 0,1 М цитрате натрия, рН 5,4, методом диффузии паров висячих капель и криозащитили в 30% глицерине.

Данные рентгеновской дифракции были собраны на каналах GM/CA и SER-CAT в Advanced Photon Source, Аргоннская национальная лаборатория. Данные были обработаны и масштабированы с помощью XDS⁵⁹. Молекулярную замену проводили в PHASER⁶⁰ используя Pfs25 (идентификатор PDB: 6phb)³⁸ и модель антител, сгенерированная сервером BodyBuilder в качестве поисковых моделей⁶¹. Первоначальные модели были построены с использованием автосборки PHENIX, а итерации построения и уточнения модели проводились с использованием COOT.⁶² и ФЕНИКС⁶⁰ уточнить.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводка отчетов об исследованиях природы ссылка на эту статью.