Сбор образцов растений
Полностью развитые свежие листья C. macrostachyus и D. angustifolia, Rhizomes of K. foliosa и корни R. abysinicus были собраны из ботанического сада Гулеля в течение месяца ноября 2022 года. Географически область расположена на центральном плато этиопии, с координатами, простирающимися между латитутами 85 и 9 ° 05, и длительными, а также длительными и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, и длительными, а также длительными, простирающимися между Латитудами 855 лет. 38 ° 05′E и 39 ° 05′E. Сад расположен к северо -западу от Аддис -Абебы, примерно в 4 км от центра. Топография варьируется от очень крутых до умеренно крутых склонов. Среднегодовое количество осадков составляет от 1100 до 1300 мм, а годовая температура колеблется от 15 до 18 ° C, а февраль – самый жаркий месяц (20,7 ° C) [20]Полем
После сбора растения были аутентифицированы таксономистом Мелаку Вондафраш из национального гербария. Образцы ваучеров (ST001 до ST005, соответственно) были внесены в Национальный гербарий, Колледж природных и вычислительных наук, Университет Аддис -Абаба, Эфиопия для будущей ссылки.
Подготовка части растения
Части растений промывали водопроводной водой и отдельно высушивали в тени при комнатной температуре в течение двух недель. Корни и корневища затем разрезали на более мелкие кусочки и садились в порошок вручную, используя раствор и пестик. Аналогичным образом, сушеные части листа были измельчали раствором и пестиком и проходили через сито, чтобы получить тонкий порошок. Порошковые материалы хранили при комнатной температуре в меченных воздушных пластиковых пакетах до использования [21]Полем
Извлечение растительных материалов
Крупно порошкообразные растительные материалы D. angustifolia (250 г), C. macrostachyus (850 г), K. foliosa (298 г) и R. abyssinicus (195 г) были отдельно помещены в мацеральные контейнеры. Чистый метанол (99,9%) добавляли в каждый контейнер, пока растительные материалы не будут полностью покрыты. Контейнеры были запечатаны и оставлены в течение трех дней с периодическим перемешиванием. После извлечения смесь отделяли от остатка растения (MARC) фильтрацией. Метанольные сырочные экстракты были дополнительно отфильтрованы через фильтрованную бумагу Whatman № 3 (Whatman International Ltd., Мейдстон, Великобритания). Фильтраты концентрировали с использованием вакуумного вращающегося испарителя (Rota-Vapor-RE, Buchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland), установленного при 40 ° C при пониженном давлении. Остатки из каждого растительного экстракта давали остыть при комнатной температуре, чтобы удалить оставшийся растворитель. Затем экстракты собирали в отдельных стеклянных бутылках Уитона, сушили в горячей духовке и хранили в холодильнике при 4 ° С до использования [21, 22]Полем Выходы составляли 9,2%, 5,13%, 9,56%и 7,8%для D. angustifolia, C. macrostachyus, K. foliosa и R. abyssinicus, соответственно.
Фракционирование экстрактов
Фракционирование было выполнено на грубых экстрактах C. macrostachyus и K. foliosa, которые проявляли наиболее мощные лирвицидные и взрослые эффекты. Каждый сырой экстракт был приостановлен в 250 мл дистиллированной воды и последовательно фракционировал в разделяющей воронке с использованием растворителей различной полярности. Первоначально к экстракту добавляли равную долю этилацетата, тщательно перемешивали и позволяли поддерживать фазовое разделение. Затем этилацетатный слой собирали. Затем в оставшуюся водную фазу добавляли 250 мл N-бутанола с последующей встряхиванием и фазовым разделением для получения фракции N-бутанола. Оставшаяся водная фаза сохранялась в качестве водной фракции [22, 23]Полем Чтобы обеспечить полное извлечение всех растворимых соединений, процедура повторялась три раза. Фракции сконцентрировали с помощью вращающегося испарителя, в то время как водная фракция концентрировали с использованием сушилки замораживания. Выходы были следующими: C. macrostachyus: этилацетат (55%), N-бутанол (30%) и водные (15%) фракции; Для К. Фолиоса: этилацетат (42%), н-бутанол (35%) и водные (27%) фракции.
Подготовка и разбавление фондового раствора
Чтобы подготовить запасы, один грамм каждого экстракта растворяли в 100 мл дистиллированной воды в стеклянной бутылке Weaton 250 мл, что привело к раствору 1% (10000 ч / млн). Чтобы помочь растворимостью, одну каплю эмульгатора (Tween 80) добавляли при концентрации 0,05%. Из этого запаса раствора различные концентрации получали путем разбавления специфических объемов дистиллированной водой до конечного объема 100 мл. В частности, 250 мкл, 500 мкл, 1000 мкл, 2000 мкл и 4000 мкл раствора 1% разбавляли для получения конечной концентрации 25 ч / млн, 50 ч / млн, 100 ч / млн, 200 ч / млн и 400 ч / млн соответственно. Тот же процесс разбавления был применен как для сырой экстракта, так и для его фракций, чтобы обеспечить согласованность концентрации во всех испытательных образцах.
Выращивание Anopheles gambiae
Взрослые и лирвицидные биоанализа проводились на колонии личинок и взрослых. Gambiae, происходящие из района Бату, Восточная Оромия, Эфиопия. Взрослые комары и личинки поддерживались при относительной влажности 70 ± 10% и 27 ± 2 ° C у насекомых в Бату. Основное оборудование, такое как клетки насекомых, пластиковые лотки личинок и контейнеры, было расположено, чтобы минимизировать риск случайных выпусков. Личинки на стадиях L1 и L2 собирали с поля обученными энтомологами и хранились в пластиковых лотках (20 × 15 × 5 см), содержащей деионизированную воду, в рамках цикла света и темноты 12:12 в лаборатории после стандартных процедур выращивания комаров [24]Полем Личинки кормили дрожжами (саф-жесткие дрожжи) на пластиковую блюдо, а вода менялась каждые три дня. Куколки собирали с использованием стеклянного стакана и переносили в 24,5 × 24,5 × 24,5 см клеток (общежития ошибок) для появления взрослых. Вновь появившиеся взрослые поддерживали в клетках комаров при 28 ± 3 ° C и 70 ± 10% относительной влажности, и получали стерильным 10% сахарным раствором, пропитанными в хлопковых прокладках в чашке Петри. Хлопковые прокладки сохранялись влажными и ежедневно менялись. Для испытаний взрослых и личинга, личинок с 3 до начала 4 -го возраста и от 3 до 5 дней взрослых женщин. Gambiae были использованы.
Личиночный биоанализ
Активность личинки была измерена в соответствии со стандартными процедурами ВОЗ [25]Полем Для этого, экстракты метанола из четырех растений и фракций двух наиболее активных экстрактов были протестированы в желаемых концентрациях. Двадцать личинок были перенесены в стаканы 100 мл, содержащие соответствующую концентрацию экстрактов/фракций, 50 мкл Tween 80 (в качестве эмульгатора) и дистиллированной воды. Точно так же 50 мкл Tween 80, смешанного с дистиллированной водой, использовали для приготовления 100 мл раствора, который служил отрицательным контролем. Temephos при концентрации 0,25 ppm в растворе 100 мл использовали в качестве положительного контроля [26]Полем Эксперимент проводился в течение 48 часов в оптимальных условиях, как упоминалось ранее у насекомого. Личинки, подвергшиеся воздействию растительных экстрактов и контролей, не были обеспечены пищей. Каждый эксперимент был воспроизведен три раза в разные дни, с соответствующими отрицательными контролями и стандартными проверками. Число мертвых личинок было зарегистрировано после 48 ч воздействия, и процентная смертность была рассчитана по среднему из двенадцати повторов. Мертвые личинки включали умирающих людей, определяемых как неспособные подняться на поверхность. Результаты различных групп были усреднены для определения значений LC50 и LC90.
Взрослый биоанализ
Метод биоанализа бутылок CDC был использован для проверки взрослой активности экстрактов/фракций [8]Полем Из -за развития сопротивления большинству доступных в настоящее время синтетических инсектицидов с помощью AN. Gambiae, в экспериментальную процедуру не было включено никакого положительного контроля [27, 28]Полем Бутылки Уитона (250 мл) с винтовыми крышками, которые были надлежащим образом очищены и высушены, были покрыты 1 мл желаемых концентраций экстрактов/фракций путем кружиться, чтобы обеспечить полное покрытие бутылки и ее крышки. Точно так же в управляющую бутылку добавляли 1 мл раствора Tween 80, которая обрабатывалась таким же образом. Используя аспиратор рта, 20 взрослых комаров (от 3 до 5 дней и кормились на 10% сахарозы) переносили в каждую экспериментальную и контрольную бутылку. После переноса комаров, отверстия для бутылок были надежно закрыты с их кепками. Комары подвергались воздействию в течение 2 часов, а смертность наблюдалась через 48 часов. Процедура была выполнена поддержание оптимальных условий у насекомого.
Анализ данных
Средняя процентная смертность и зависимая от концентрации скорость смертности была проанализирована с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 8.2.1 (Prism.exe). Средний процентный уровень смертности личинок и взрослых был протестирован на нормальность с использованием теста Kolmogorov-Smirnov (KS) с 1 выборкой (KS), и были обнаружены данные, которые обычно распределены. Следовательно, односторонний ANOVA с последующей последующей тест Tuckey был использован для сравнения среднего процентного уровня смертности среди растительных экстрактов/фракций в разных концентрациях. Значения LC50 и LC90 были рассчитаны с использованием обобщенной линейной модели Probit SPSS с достоверным интервалом 95%. Статистическая значимость была установлена при значении p <0,05. Несмотря на то, что ВОЗ не существует указанных критериев, в немногих исследованиях используются значения LC50 в качестве критерия для определения уровня активности взрослых и лирвицидных потенций растительных продуктов. Соответственно, продукт считается очень активным, если LC50 <50 ч / млн, активно, если LC50< 100 ppm, moderately active if LC50 is between 100 ppm and 200 ppm, weakly active if LC50 is between 200 ppm and 750 ppm, and inactive if LC50 >750 ч / млн [29]Полем
2025-07-30 11:45:00
1753876237
#Лирвицидные #взрослые #эффекты #эфиопских #лекарственных #растений #против #Anopheles #gambiae #Diptera #Culicidae #Малярия #Журнал
Продолжение темы
