Обнаружение вируса оспы обезьян с использованием хеликазозависимой амплификации и амплификации рекомбиназной полимеразы в сочетании с тестом латерального потока | Вирусологический журнал

В последние годы MPX превратился в глобальную эпидемию и «чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения, имеющую международное значение». [14]. В начале своего открытия MPX часто ошибочно диагностировали как оспа из-за сходства ее симптомов с симптомами оспы. Поскольку оспа ликвидирована, рутинная диагностика MPX в первую очередь предполагает отличие ее от ветряной оспы, вызванной вирусом ветряной оспы (VZV). [15]. В настоящее время MPXV быстро распространяется в неэндемичных странах и регионах, а подтвержденные случаи оспы обезьян последовательно обнаруживаются в Европе и на Севере. Диагностика и выявление оспы обезьян, являющаяся решающим шагом в процессе профилактики и контроля эпидемии, требует поддержки многочисленных типов технологий диагностики и обнаружения, быстрого обнаружения, обнаружения на месте в специальных местах, клинической диагностики, лабораторной идентификации и другая работа. Помимо разработки золотого стандарта qPCR для обнаружения вируса оспы обезьян, в этом исследовании мы разработали два новых метода обнаружения с высокой чувствительностью и специфичностью: HDA-LFT и RPA-LFT. Два вышеупомянутых метода просты в использовании; кроме того, прибор прост в использовании, результаты испытаний можно определить, наблюдая за количеством строк, отображаемых на LFT, а всю процедуру тестирования можно выполнить без необходимости специального обучения. Таким образом, ожидается, что эти два типа методов станут идеальными диагностическими инструментами для выявления MPXV в условиях неадекватной медицинской помощи и ограниченных ресурсов.

Хотя определение случая с подозрением на MPX и способы диагностики MPXV незначительно различаются в разных странах мира, их можно разделить на следующие категории: (1) Электронная микроскопия. Основное преимущество этого метода состоит в том, что результаты можно наблюдать непосредственно, без использования конкретных биологических реагентов; однако цикл длиннее, подготовка и эксплуатация проб сложнее, а лаборатория, использующая электронный микроскоп, должна быть оснащена квалифицированным техническим персоналом. (2), молекулярная диагностика [16]. К ним относятся qPCR и секвенирование нового поколения (NGS). КПЦР является методом выбора для рутинной диагностики патогенных микроорганизмов и золотым стандартом положительной диагностики MPXV. Он обладает высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения MPXV, можно эффективно идентифицировать ветви MPXV и отличить другие OPXV, но процесс амплификации требует трех этапов: денатурация, отжиг и удлинение. Для этого процесса требуется оборудование для контроля температуры, значительное количество время и квалифицированный труд [17]. Обнаружив последовательность ДНК MPXV, NGS может помочь нам лучше понять эпидемиологию, источник инфекции и способ передачи вируса. Однако NGS не подходит для крупномасштабного тестирования, поскольку он дорог и требует возможности последующей обработки данных секвенирования. [18]. (3) обнаружение антител в сыворотке, ELISA является предпочтительным методом обнаружения антител в сыворотке, используя реакцию специфического связывания антиген-антитело для качественного и количественного анализа иммунной реакции; таким образом, специфическое антитело к MPXV может быть обнаружено как в сыворотке животных, так и в человеческой сыворотке. Однако этот метод не способен обеспечить раннюю диагностику и может использоваться только для поздней вспомогательной диагностики при плохой комплаентности. [19]. (4), изоляция и культура MPXV. Хотя выделение и культивирование MPXV являются золотым стандартом диагностики вирусных заболеваний, выделение и культивирование MPXV ограничено и требует высокого уровня лабораторной биобезопасности; операции по изоляции и культивированию должны выполняться в лаборатории уровня III или выше опытным персоналом. [20]. Поэтому важно разработать метод быстрого обнаружения с высокой чувствительностью для обнаружения MPXV в средах с ограниченными ресурсами.

Впервые используя метод HDA для обнаружения MPXV, мы также объединили его с технологией RPA и LFT, чтобы определить чувствительность и специфичность трех методов обнаружения в сочетании с нашей собственной qPCR. Другие INAAT ранее уже проверялись на вирус оспы обезьян. [7, 21]. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это новый метод амплификации нуклеиновых кислот, не требующий термического циклирования. Используя технологию LAMP, Иизука и др. создали систему количественной амплификации генома вируса оспы обезьян в реальном времени. Праймеры были разработаны для воздействия на тельца включения типа А (AT1), ген D14L, специфичный для вируса оспы обезьян бассейна Конго, и часть гена AT1 из западноафриканского MPXV. LAMP использовалась для отличия штамма из бассейна Конго от штамма из Западной Африки. [22]. Хотя LAMP — удобный, эффективный и недорогой метод обнаружения [23, 24]сама методика требует значительной оптимизации и проверки для идентификации конкретных праймеров и ферментов, а также разработки множества пар праймеров и ферментов. Кроме того, ДНК-полимеразы более чувствительны к изменению температуры, склонны к ложноположительным результатам и склонны к образованию трудноустранимых аэрозолей. [25, 26]. По сравнению с анализом LAMP наши анализы HDA-LFT и RPA-LFT обладают значительными преимуществами. Простая композиция праймеров, которая устраняет необходимость использования нескольких наборов праймеров, эффективно снижает образование димеров. Высокотемпературное усиление технологии LAMP увеличивает вероятность перекрестного загрязнения, тогда как температура реакции RPA ближе к температуре человеческого тела, позволяет эффективно избегать аэрозольного загрязнения и может использоваться за пределами лаборатории ПЦР. Сочетание технологии HDA и технологии RPA с LFT не только обладает высокой чувствительностью и специфичностью, но также упрощает этапы работы, не требует сложного оборудования или профессиональной подготовки и позволяет более непосредственно наблюдать результаты реакции; следовательно, это исследование может стать идеальным инструментом для POCT. [22].

В этом исследовании специфическая последовательность F3L MPXV была обнаружена с использованием методов HDA-LFT, RPA-LFT и qPCR. Температура реакции, время реакции, концентрация праймера и концентрация dNTP были оптимизированы для технологии HDA. Как видно из результатов оптимизации, концентрация dNTP оказывает влияние на исход реакции, а когда она высока, она ингибирует реакцию и приводит к образованию димеров праймеров. Кроме того, мы оптимизировали время реакции, температуру, концентрацию праймеров, MgOAc и Nfo в методе RPA. Фермент Nfo, фермент сдвига зонда метода RPA, оказывает значительное влияние на эффективность реакции: более высокие концентрации Nfo приводят к ложноположительным результатам. Более того, при разработке обычных реакций qPCR мы оптимизировали температуру отжига, концентрацию праймера и концентрацию зонда. Из-за нашей неспособности получить клинические образцы, связанные с MPX, для нашего исследования, мы смоделировали метод добавления рекомбинантных плазмид к нормальным образцам крови, чтобы обнаружить реальные клинические образцы для решения этой проблемы. Это связано с тем, что вирус можно обнаружить в крови на ранней стадии инфекционного процесса. Эта стадия называется продромальной стадией и может возникать до появления видимых поражений кожи. Результаты теста на чувствительность показали, что LOD цели обнаружения HDA-LFT составляет 9,86 копий/мкл (95% ДИ 7,52 копий/мкл, нижняя граница), цель обнаружения RPA-LFT составляет 6,97 копий/мкл (95% ДИ 3,897). копий/мкл (нижняя граница), а целевое значение обнаружения кПЦР составляет 479,24 копий/мл (95% ДИ 273,81 копий/мл, нижняя граница). Мы использовали MPX PV, CPX PV, HS PV, VZ PV и CMPV в качестве мишеней для проверки специфичности трех вышеуказанных методов. Результаты реакции показали, что специфичность трех вышеуказанных методов в обнаружении гомологов вируса оспы обезьян составила более 90%.

Хотя это исследование продемонстрировало множество преимуществ методов HDA-LFT и RPA-LFT при обнаружении MPXV, мы признаем, что существуют некоторые ограничения: во-первых, о результатах LFT обычно судят по визуальному наблюдению за появлением полос, которые не только приводит к тому, что анализ дает только качественную оценку ответа, но также затрудняет получение точных экспериментальных результатов из-за индивидуальных различий в суждениях. Во-вторых, хотя HDA/RPA-LFT проще традиционного метода ПЦР и не требует сложного процесса изменения температуры, его можно обнаружить на водяной бане или при комнатной температуре, но его можно использовать только после предварительной обработки образца. с реагентами для экстракции нуклеиновых кислот и специальным лабораторным оборудованием, что может ослабить применимость в этой области. В будущих исследованиях мы проведем более углубленное исследование того, как использовать технологию HDA/RPA-LFT для непосредственного обнаружения клинических образцов MPXV, надеясь предоставить эффективную эталонную ценность для продвижения применения технологии обнаружения MPXV в POCT в будущем. Наконец, потенциальная контаминация является недостатком вышеуказанных методов обнаружения, что может быть вызвано открытием реакционной трубки при анализе продукта посредством LFT. Поэтому крайне важно принять меры по герметизации во время процесса анализа, чтобы предотвратить потенциальное загрязнение. Кроме того, вызывает беспокойство то, что чувствительность LOD метода qPCR в наших экспериментах в качестве контрольной группы показала некоторые различия по сравнению с чувствительностью недавно опубликованных анализов qPCR на MPXV. [27]что может быть связано с качеством реагентов, точностью инструментов и технической квалификацией операторов, а также конструкцией праймеров. Мы продолжим детально изучать и оптимизировать эти дифференциальные факторы в последующих экспериментах. В будущем процессе профилактики и контроля биобезопасности необходимо будет и дальше создавать платформу для обнаружения вируса оспы обезьян, разрабатывать эффективные и точные продукты обнаружения, постоянно повышать эффективность и точность обнаружения, а также создавать стратегические технические резервы для предотвращения несчастных случаев. Это может предотвратить возникновение серьезных инцидентов в области общественного здравоохранения.