Оптимизированный протокол для предотвращения передачи заболеваний через перенос материнской митохондриальной ДНК

Некоторые заболевания человека возникают из-за дефектов митохондриальной ДНК (мтДНК), которая отличается от ядерной ДНК и наследуется только от предков по материнской линии. Профилактика этих заболеваний с помощью митохондриальной заместительной терапии (МР) сопряжена с риском увеличения мутаций мтДНК, что впоследствии может привести к митохондриальному генетическому дрейфу.

Недавнее исследование, опубликованное в ПЛОС Биология обсуждает новый метод, позволяющий потенциально минимизировать риск передачи мутаций мтДНК, одновременно максимизируя выживаемость и развитие эмбрионов.

Изучать: Значительное снижение переноса материнских митохондрий за счет оптимизированного переноса веретено-хромосомного комплекса.. Изображение предоставлено: nobeastsofierce / Shutterstock.com

Введение

Внутри митохондрий субстраты подвергаются окислительному фосфорилированию с образованием аденозинтрифосфата (АТФ). Митохондрии содержат собственную ДНК в виде двухцепочечной кольцевой хромосомы.

Хотя мтДНК очень короткая и содержит всего 37 генов, мутации могут возникать в результате наследования или генетического дрейфа во время эмбрионального развития. Здоровье эмбриона тогда зависит от уровня пролиферации гетероплазматической мтДНК.

При высоких уровнях мутантная мтДНК может преобладать и способствовать развитию таких клинических симптомов, как слепота, глухота, диабет, печеночная недостаточность или мышечная слабость. Эти симптомы могут проявиться в любом возрасте.

Это побудило исследователей определить подходы, которые могут предотвратить эти заболевания, предотвращая их передачу с помощью таких подходов, как MR. МР предполагает замену митохондрий гамет, участвующих в зачатии, или эмбриона, образовавшегося в результате зачатия, с использованием переноса веретена или других методов.

Что такое СККТ?

Одним из эталонных подходов МР является перенос веретено-хромосомного комплекса (SCCT). Здесь исследователи манипулируют формированием веретена во время метафазы II (MII) стадии клеточного деления, во время которой хромосомы разделяются на два полюса клетки и прикрепляются к волокнам веретена. Отцовские и материнские хромосомы расходятся к противоположным полюсам клетки.

При SCCT веретено, к которому прикреплены хромосомы материнского происхождения, удаляется из неоплодотворенного ооцита, который представляет собой ядерную ДНК материнского происхождения. Эти хромосомы впоследствии переносят путем микроманипуляции в яйцеклетку-реципиент от женщины-донора, из которой из пустого ооцита извлекают ядро.

Затем происходит оплодотворение новой или реконструированной яйцеклетки. Сообщалось об успешном оплодотворении и развитии ооцитов макак-резус, за которыми последовали аналогичные эксперименты на ооцитах человека. Анализ бластоцист и линий эмбриональных клеток (ЭСК) на этих моделях животных показал, что уровни мтДНК были неопределяемыми.

Первое рождение человека после зачатия с использованием SCCT произошло в Мексике в 2017 году, в нем приняли участие три родителя.

Даже при использовании SCCT в нескольких экспериментах сообщалось о митохондриальном генетическом дрейфе. Это может быть связано с тем, что веретено-хромосомный комплекс (SCC) содержит небольшое количество цитоплазмы, содержащей некоторое количество митохондрий, что приводит к переносу гетероплазматической или мутантной мтДНК в ооцит-реципиент. Это подвергает сконструированные таким образом ооциты риску генетического дрейфа. Таким образом, человек, зачатый из этих ооцитов, более уязвим к риску последующего митохондриального заболевания.

Ограничения этих методов побудили исследователей текущего исследования изучить новый метод микроманипуляции при SCC. Целью этого исследования было минимизировать риск переноса мтДНК, тем самым предотвращая генетический риск и клинические митохондриальные заболевания. Новый метод, который они предлагают в настоящей статье, называется максимальным удалением остатков (MRR).

Что такое МРР?

SCC из ооцитов мыши и человека удаляли с помощью очень тонкой микропипетки. Цитоплазму, окружающую ПКК, в дальнейшем удаляли методом «откидывания» в специальной смеси. Отдельные SCC оценивали, чтобы убедиться в достижении MRR и в том, что число копий мтДНК и вариация числа генетических копий (CNV) остались неизменными.

После этого мышиные ооциты были реконструированы с использованием мтДНК из разных клеток. Развитие ооцитов исследовали после оплодотворения путем интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) на стадии бластоцисты. Также определяли уровень гетероплазмии мтДНК и число копий хромосом.

SCCT слишком рано запускал активацию реконструированного ооцита и, как следствие, вызывал его вступление в мейоз и приводил к преждевременному аномальному оплодотворению. Чтобы решить эту проблему, сначала была проведена ИКСИ, а затем МРР.

Этот новый подход увеличил успешное оплодотворение, сократил время и количество яйцеклеток, которыми, возможно, придется пожертвовать. SCC также оставался морфологически интактным после этих процедур, а анализ CNV показал нормальное количество хромосомных копий.

Этот новый подход к удалению митохондрий при MRR не поставит под угрозу целостность веретена и хромосомы и может быть легко реализован при переносе ядра.».

Процедура SCC-MRR не препятствовала нормальному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию.

Оплодотворенные яйцеклетки трансплантировали в яйцеводы, что приводило к появлению здорового потомства примерно в 30% случаев. Это вполне сравнимо с эффективность традиционный перенос эмбрионов SCC. Гетероплазмия мтДНК составляла около 1,5% у потомков SCCT-MRR по сравнению с примерно 4,1% у эмбрионов обычного SCC.

Это потомство выросло до взрослого возраста и нормально спаривалось с самцами дикого типа. Потомство второго поколения также имело низкий остаток мтДНК – около 0,5%.

Линии ЭСК SCCT-MRR появлялись и вели себя как контрольные и стабильные линии ЭСК, тогда как обычные ЭСК SCCT-MRR демонстрировали повышенную гетероплазмию мтДНК. Таким образом, этот метод не привел к генетическому дрейфу мтДНК.

MRR-SCCT может значительно снизить передачу мтДНК донора веретена до самого низкого уровня в стабильном состоянии в мЭСК.».

Эти манипуляции также проводились на стадии MII ооцита, что привело к правильному развитию эмбрионов SCCT-MRR с минимальным переносом мтДНК. При использовании этого метода перенос мтДНК снизился до 0,04%, что является самым низким уровнем, когда-либо зарегистрированным в экспериментах SCCT на людях.

Высокая частота оплодотворения, доля эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, и уровни эуплоидии были сопоставимы с неманипулированными человеческими ооцитами, полученными с помощью ИКСИ.

Каковы последствия?

Уровни мтДНК последовательно снижались до очень низких и стабильных уровней в кариопластах, реконструированных ооцитах и ​​производных бластоцистах после SCCT-MRR. Более того, уровни мтДНК составляли примерно одну шестую от уровня, полученного при обычном SCCT у мышей, и оставались стабильными в первом и втором поколениях потомства.

Эти данные подтверждают гипотезу о том, что больший объем остаточной мтДНК связан с повышенным риском генетического дрейфа. Этот подход также, по-видимому, не увеличивает риск веретено-хромосомных дефектов, вызванных манипуляцией.

Более ранние исследования бесплодия у людей показали, что низкий перенос мтДНК на стадии бластоцисты по-прежнему сопровождается увеличением от 0,8% до 60% в различных тканях к моменту рождения. Этот дрейф гетероплазмии наблюдался и в других экспериментах на ЭСК человека.

Поэтому мы считаем, что перед клиническим внедрением текущей стратегии MRR-SCCT потребуются дополнительные исследования с участием ЭСК человека.».