В недавнем исследовании, опубликованном в Патогены PLoSисследователи исследовали рецепторный тропизм и серологическую перекрестную реактивность в отношении рецептор-связывающих доменов (RBD) белка шипа (S) двух сарбековирусов клады 3, обнаруженных у русских носорогов (подковообразных) летучих мышей: Хоста-1 в Ринолофус феррумеквинум и Хоста 2 в R. гиппосидероскоторые отличаются от рецептор-связывающих доменов (RBD) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-1 (SARS-CoV-1) и коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS-CoV-2).
Зоонозное распространение сарбековируса SARS-CoV-2 привело к пандемии коронавирусной болезни 2019 (COVID-19). Несколько сарбековирусов были обнаружены у азиатских летучих мышей; однако большинство из них не заражают людей. Исследователи ускорили усилия по обнаружению вирусов во всем мире, расширив геномные базы данных новыми зоонозно передающимися и циркулирующими сарбековирусами.
Авторы и другие исследователи разделили RBD сарбековирусов на три клады: вирусы клады 1 среди азиатских летучих мышей не содержат делеций и связываются с рецептором hACE2 (человеческий ангиотензинпревращающий фермент 2); вирусы клады 2 среди азиатских летучих мышей содержат две делеции и не связываются с hACE2; Вирусы клады 3 среди европейских и африканских летучих мышей содержат одну делецию и связываются с hACE2. В 2021 году среди китайских летучих мышей были обнаружены вирусы, включающие кладу 4, которые также связываются с hACE2.
Об исследовании
В настоящем исследовании ученые исследовали заражение клеток-хозяев сарбековирусом S российских летучих мышей Rhinolophus и их нейтрализацию моноклональными антителами (mAb) и сывороткой вакцинированных доноров.
Был синтезирован полноразмерный ген Khosta S, RBD SARS-CoV-1 S был заменен на RBD вирусов Khosta, и были созданы химерные экспрессионные плазмиды S. Кроме того, для сравнительного анализа были включены химерные RBD S из других ранее протестированных вирусов клады 3 (BM48-31, Уганда), SARS-CoV-2 и родственных вирусов RaTG13. Химерные S-конструкции генерировали VSV (вирус везикулярного стоматита)-псевдотипированные VLP (вирусоподобные частицы), несущие химерные SARS-CoV-2 S с RBD Khosta, чтобы имитировать потенциальную рекомбинантную угрозу от вирусов Khosta.
Кроме того, клетки Huh-7 (линия клеток печени человека) инфицировали VLP, несущими химерные RBD Khosta S, для проверки вирусной совместимости с клетками человека. Для характеристики потенциальных рецепторов вируса Хоста был проведен тест на тропизм рецепторов, в котором клетки почек детенышей хомяка (BHK) трансфицировали человеческими ортологами известных рецепторов CoV и впоследствии инфицировали вирусными псевдотипами. Эффективность проникновения человека между вирусными S-белками и человеческим ACE2 (hACE2) дополнительно оценивали путем инфицирования hACE2-экспрессирующих 293T-клеток.
«Клетки-продуценты» 293Т лизировали, и лизаты подвергали вестерн-блоттингу. Чтобы изучить белковые взаимодействия между Khosta 2 и hACE2 по сравнению с другими RBD клады 1 S, прогнозы структуры RBD Khosta 2 были сделаны на основе ранее опубликованных данных, которые затем были сопоставлены с помощью множественного выравнивания последовательностей (MSA) с ACE2-связанным SARS-CoV- 1 и коструктуры SARS-CoV-2 для филогенетических оценок.
Эксперименты с псевдотипами повторяли с сыворотками, полученными от вакцинированных лиц. Для сравнения нейтрализации вызывающих озабоченность (VOC) вариантов Khosta 2 и SARS-CoV-2, RBD Omicron VOC S SARS-CoV-2 был создан и протестирован на образцах сыворотки, полученных от шести вакцинированных (двукратно вакцинированных вакцинами Pfizer или вакцинами Moderna). ), четыре неинфицированных донора и трое вакцинированных с прорывными инфекциями Omicron.
Были получены человеческие ортологи ACE2, APN (аминопептидаза N) и DPP4 (дипептидилпептидаза IV) и последовательности плазмиды S из человеческого CoV (HCoV)-229E, ближневосточного респираторного синдрома CoV (MERS-CoV) и SARS-CoV-1. . Анализы нейтрализации проводили с использованием сыворотки вакцинированных доноров и бамланивимаба, RBD-специфического mAb против SARS-CoV-2.
Результаты и обсуждение
Экзогенная протеаза опосредовала проникновение RBD Khosta-1 в клетки Huh-7; однако добавление протеазы не способствовало проникновению RBD Khosta-1 в клетки BHK, трансфицированные несколькими рецепторами CoV, что указывает на то, что трипсин-зависимое проникновение Khosta-1 в клетки Huh-7 не зависело от hACE2. Напротив, добавление трипсина усиливало рецептор-зависимые входные сигналы для RBD SARS-CoV-2 и RBD Khosta 2, указывая на то, что RBD Khosta 2 использовали рецепторы hACE2 для клеточной инфекции. Однако полноразмерный штамм Khosta 2 S оказался менее заразным, чем химерный S на основе SARS-CoV.
Хоста 2 RBD инфицировал клетки, экспрессирующие hACE2, с уровнями проникновения в клетки, сравнимыми с RaTG13, hACE2-связывающим сарбековирусом летучих мышей, очень похожим на RBD SARS-CoV-2. Оба RBD африканской ветви 3 также продемонстрировали связывание hACE2, хотя и со значительно меньшей эффективностью, чем SARS-CoV-2. Вопреки выводам о рецепторе hACE2, только HCoV-229E и MERS-CoV инфицировали клетки, экспрессирующие APN, и клетки, экспрессирующие DPP4 MERS-CoV, соответственно.
удивления, Omicron S был эффективно нейтрализован бамланивимабом, тогда как SARS-CoV-2 S с RBD Khosta 2 показал небольшую устойчивость (и полную устойчивость к штамму Wuhan-Hu-1) даже при высоких разведениях сыворотки, что указывает на небольшую перекрестную реактивность между два РБД. Аналогичные результаты наблюдались при использовании сывороток вакцинированных доноров.
Более высокая устойчивость к нейтрализации с помощью Khosta 2, чем у SARS-CoV-2, может быть связана с тем, что RBD Khosta 2 и RBD SARS-CoV-2 схожи только на 60%, а реакции нейтрализации, вызванные вакцинацией, в основном были направлены на RBD. Бамланивимаб связывается с 17 остатками штамма SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1, 10 из которых являются общими для Khosta 2. Кроме того, ускользание бамланивимаба может быть связано с мутациями Omicron Q493R и E484A; Хоста 2 кодирует G435 на сайте, аналогичном E484 на SARS-CoV-2.
В целом, результаты исследования выявили предпочтение рецептора hACE2 в вирусах Khosta 2 ветви 3 с использованием псевдотипированных VLP с химерными и полноразмерными белками ветви 3 S. Псевдотипированные VLP, содержащие рекомбинантный SARS-CoV-2 S-кодирующий Khosta 2 RBD, сопротивлялись нейтрализации, что указывает на то, что новые рекомбинантные сарбековирусы, циркулирующие за пределами Азии, могут угрожать текущей эффективности вакцины против COVID-19.
