1766411399
2025-12-22 13:09:00
Для регистрации острых срезов инъецированных животных (см. Стереотаксические инъекции: для электрофизиологических экспериментов.) подвергали глубокому наркозу капельным методом изофлюрана в колпаке (с приподнятой площадкой для животного) и немедленно транскардиально перфузировали 8–10 мл ледяной оксигенированной (95 % О2, 5 % СО2) искусственной цереброспинальной жидкости, содержащей (в мМ): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 и 25 глюкоза. Затем мозг извлекали, приклеивали на платформу вибратома (Leica Biosystems, Германия) и блокировали для коронарных срезов с использованием кубика агарозы (5%) и нарезали в том же растворе (ледяном). Срезы разрезали до толщины 365 мкм. Затем срезы головного мозга переносили в насыщенную кислородом искусственную спинномозговую жидкость температурой 32–34°C, которой давали возможность вернуться к комнатной температуре в течение 1 часа, что составляло период восстановления срезов.
Срезы, содержащие неясную зону и окончания входов ядер мозжечка, визуализировались с использованием дифференциального интерференционного контраста с помощью микроскопа Zeiss Axioskop 2FS. Флуоресценцию от экспрессии ChR2-EYFP и от ретроградного фтор-рубинового мечения подтверждали с использованием 5-кратного воздушного объектива и управляемых мест записи в неясной зоне. Записи были сделаны с помощью усилителя Multiclamp 700B и программного обеспечения pCLAMP (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния). Регистрирующие стеклянные пипетки сопротивлением 7–9 МОм заполняли внутренним раствором следующего содержания (в мМ): 117 K-глюконат, 13 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 Hepes, 0,1 EGTA, 2 Na2-ATP, 0,4 Na-GTP, pH 7,3, 290 мОсм. Для регистрации были выбраны инцертальные клетки, морфология которых четко выявлялась по сильной красной флуоресценции, указывающей на ретроградное мечение из заднемедиального таламуса. Нанесение ТТХ (1 мкМ) в ванну осуществляли на подмножестве зарегистрированных клеток для проверки моносинаптической природы мозжечкового входа в неясную зону.
Оптогенетическую стимуляцию осуществляли с использованием лазера с длиной волны 355 нм (DPSS: 3505–100), контролируемого с помощью зеркал гальванометра (Нованта, Бедфорд, Массачусетс), сфокусированных на срезе через 5-кратный воздушный объектив с использованием специального программного обеспечения в MATLAB (The MathWorks, Inc, Натик, Массачусетс; RRID:SCR_001622). Фокальную фотостимуляцию синаптических терминалей, экспрессирующих ChR2, в неясной зоне проводили при частоте 10 Гц (четыре импульса длительностью 1 мс с межстимульным интервалом 100 мс).
#Лазающие #волокна #мозжечка #влияют #на #зависящую #от #опыта #пластичность #первичной #соматосенсорной #коры #головного #мозга #мышей
Ещё по этой теме
