Генетически модифицированные цыплята показали устойчивость к птичьему гриппу в ходе исторического исследования

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Природные коммуникации, Исследователи разработали устойчивых к птичьему гриппу цыплят посредством редактирования мультигенных кластерных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR/Cas9), нацеленных на кислотный ядерный фосфопротеин 32 (ANP32)A, ANP32B и ANP32E для ингибирования репликации вируса и предотвращения механизмов бегства вируса.

Изучать: Создание устойчивости к инфекции птичьего гриппа путем редактирования генома семейства генов ANP32. Изображение предоставлено: Сонседская Юлия / Shutterstock

Фон

Вирусы гриппа А (IAV) представляют собой значительные глобальные экономические, медицинские и пандемические риски из-за их воздействия на домашнюю птицу и потенциального заражения людей. Существующие стратегии борьбы, такие как вакцинация, ненадежны и противоречивы, что подчеркивает необходимость инновационных решений. Взаимодействие между полимеразой рибонуклеиновой кислоты (РНК) IAV и специфичными для хозяина белками ANP32 является ключом к способности вируса заражать различные виды. Однако комплексные решения требуют дальнейших исследований вирусной адаптации. эффективность редактирование нескольких генов и более широкие последствия таких генетических изменений.

Об исследовании

Оплодотворенные яйца от стад несушек Hy-line в Национальном исследовательском центре птиц в Соединенном Королевстве (Великобритания) использовались в экспериментах, которые соответствовали правилам Великобритании, проверялись советами по этике и проводились лицензированным персоналом. Первичные зародышевые клетки (ПГК) извлекали из яиц, культивировали и размножали перед редактированием генов. Для редактирования использовались различные векторы CRISPR/Cas9, последовательности были выбраны с помощью инструмента проектирования и синтезированы такими компаниями, как Invitrogen и Integrated deoxyribonucleic acid (DNA) Technologies. Для редактирования генов ANP32A, ANP32B и ANP32E было использовано несколько стратегий. Отредактированные клетки проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру со специфическими праймерами для каждого изменения гена.

Для анализа транскриптома PGC были расширены, РНК впоследствии экстрагирована и подвергнута проверке качества, затем использована для создания библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) с последующим выполнением секвенирования РНК, при этом полученные считывания подвергаются фильтрации и анализу качества. Данные были сопоставлены со сборкой генома курицы и проведен анализ дифференциальной экспрессии. Этот обширный процесс обеспечил тщательное, регулируемое изучение и модификацию генов PGC в исследовательских целях.

В исследовании экспрессию ANP32A анализировали как в клетках с отредактированным геном, так и в эмбрионах с нокаутом ANP32A (AKO), используя лизирующий буфер радиоиммунопреципитационного буфера (RIPA) и ряд протоколов для лизиса и последующего вестерн-блоттинга. Специфические антитела использовались на этапе иммуноблоттинга с последующим процессом визуализации с использованием системы визуализации Odyssey. В другом эксперименте 150 000 PGC подверглись дифференцировке в фибробластоподобные клетки посредством серии инкубаций и смен среды с использованием специфических условий и ингредиентов культуральной среды. Клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) содержались в определенных условиях, и использовался специальный набор клеток eHAP1 человека с тройным нокаутом.

Полимеразную активность гриппа оценивали с использованием системы минигенома polI курицы и различных плазмид. Перед оценкой биолюминесценции применяли различные процедуры и ингредиенты для трансфекции, инкубации и лизиса. В экспериментах in vivo участвовали цыплята-несушки Hy-line со специальными процедурами содержания, прививки и мониторинга для изучения передачи вируса гриппа. Для титрования вируса использовали различные анализы, включая анализ бляшек на клетках MDCK и анализы ингибирования гемагглютинации.

Кроме того, вирусы, выделенные из куриных мазков, были секвенированы после инокуляции в куриные яйца и сбора жидкости с подробными протоколами экстракции РНК, ПЦР-амплификации и секвенирования. Исследования инфекции эпителиальных клеток дыхательных путей человека включали специальные протоколы промывания, инфицирования и сбора. Был проведен конкурентный анализ между различными штаммами вируса в куриных яйцах или клетках человека с тщательной процедурой экстракции РНК, генерации кДНК и ПЦР-амплификации.

Статистический анализ проводился с использованием различных методов в зависимости от эксперимента, включая Т-тесты и дисперсионный анализ (ANOVA), среди прочего, с графическими иллюстрациями для ясности и всесторонней интерпретации.

Результаты исследования

Исследователи использовали CRISPR/Cas9 и матрицу короткого одноцепочечного олигонуклеотида (ssODN) для создания небольшого, но значительного изменения в курином гене ANP32A, намеревающегося помешать репликации IAV. Это изменение, выполненное в PGC, было тщательно проанализировано и не выявило никаких нецелевых мутаций или значительных изменений экспрессии генов. Примечательно, что активность полимеразы IAV была затруднена в отредактированных клетках, что подчеркивает роль ANP32A в репликации вируса.

а Схема заражения in vivo низкими дозами 2-недельных цыплят вирусом гриппа А H9N2-UDL (A/chicken/Pakistan/UDL01/08). Цыплята содержались в птичниках с отрицательным давлением. Перед заражением у всех птиц брали кровь из вен крыльев для получения сыворотки, предшествующей заражению. Группы из десяти цыплят WT (черных) или десяти ANP32A.^{Н129И-Д130Н} (белых) цыплят интраназально инокулировали 1 × 10³ БОЕ вируса H9N2-UDL на птицу. Неинокулированных контрольных цыплят помещали в изоляторы через 24 часа после заражения для оценки передачи вируса от непосредственно инокулированных птиц. Ротоглоточные полости каждой птицы брали тампонами ежедневно со дня инокуляции (D0) до 7-го дня (D7) после инокуляции. Титр инфекционного вируса в мазках измеряли методом бляшечного анализа на клетках MDCK (б, с). с Идентификационный номер птицы для прямого прививки ANP32A^{Н129И-Д130Н} птиц выше предела обнаружения. Предел обнаружения DL составляет 10 БОЕ/мл для анализа бляшек.

Генетическое вмешательство было осуществлено путем переноса отредактированных PGC в эмбрионы-хозяева, что привело к рождению живых цыплят, которые генерировали исключительно отредактированные гаметы. Впоследствии этих птиц спаривали, и потомство носило желаемые генетические изменения. Наблюдения показали нормальное развитие, поведение и рост у обработанных цыплят, сходных с их собратьями дикого типа.

Эффективность этой генетической модификации была проверена путем воздействия на цыплят IAV. Примечательно, что, хотя вирус процветал у птиц дикого типа, он был практически неактивен в популяции, отредактированной ANP32A, за исключением одного случая снижения вирусной активности. Последующие серологические тесты в значительной степени подтвердили отсутствие активных инфекций в отредактированной группе, намекая на потенциал этого генетического подхода в создании цыплят, устойчивых к IAV, что является прорывом, имеющим существенные последствия для здоровья птиц и связанных с ними отраслей.

Устойчивость отредактированных цыплят дополнительно оценивали в отношении повышенного воздействия IAV. Даже когда они подверглись дозе вируса, в тысячу раз превышающей дозу вируса, у модифицированных цыплят не было никаких признаков инфекции, что резко контрастировало с группой дикого типа, которая демонстрировала выраженную вирусную активность и передачу. Среди обработанных цыплят было отмечено минимальное и спорадическое выделение вируса, что указывает на значительное снижение вирусной активности и распространения из-за генетической модификации.

Углубленный анализ вирусов от отредактированных кур выявил специфические мутации, особенно в пределах PA. а именно ген кислого белка полимеразы и PB2 а именно гены основного белка 2 полимеразы. Эти мутации усилили взаимодействие между вирусной полимеразой и модифицированным белком ANP32A, что может иметь потенциальные последствия для здоровья человека, поскольку те же мутации также улучшили эффективность вируса с человеческими белками ANP32. Однако эти мутации не дали явного преимущества в куриных клетках или яйцах, что указывает на дальнейшую сложность потенциальной адаптации вируса к человеку, что, возможно, требует дополнительных изменений в белке вирусного гемагглютинина (НА).

Дальнейшие структурные исследования показали, что эффекты этих мутаций могут быть опосредованы косвенными структурными изменениями, а не прямыми взаимодействиями с белком ANP32A, что подчеркивает сложную динамику вируса-хозяина в видовом барьере гриппа и рисках адаптации.

Более того, в условиях отсутствия ANP32A двойной мутантный ускользающий вирус H9N2-UDL PA-349K PB2-M631L реплицировался в куриных эмбрионах, что свидетельствует о его адаптивности. Эксперименты также показали, что полное удаление ANP32A не полностью сдерживает определенные мутантные штаммы гриппа, что указывает на необходимость более широких изменений во всех вариантах ANP32 для достижения полной устойчивости к гриппу у кур.