Клинические образцы ткани
Все образцы ткани в этом эксперименте были получены из доминкой в больнице Янтай Юхуандинг. Было собрано приблизительно 15 см пуповины от здоровых новорожденных, доставляемых влагалищами. Перед доставкой были проведены тесты на инфекционные заболевания, такие как гепатит В, сифилис, микоплазма и хламидиоз, все они дали отрицательные результаты. Согласие было получено от матерей и их семей до сбора образцов пуповины с информированными формами согласия, должным образом подписанными. Процесс сбора проводился в стерильных условиях, а образцы погружали в среду для культивирования стволовых клеток пуповины. Затем их транспортировали в стерильных 50 мл центрифужных пробирках в центральную лабораторию больницы Янтай Юхуандинг при 4 ° C, при этом разделение завершено в течение четырех часов. Использование этих образцов было одобрено Комитетом по этике больницы Янтай Юхуандинг (№ 2024 – 554).
Изоляция и культура UC-MSCS
UC-MSC были получены с использованием метода культивирования тканевых блоков15. Короче говоря, медицинские щипцы 14# и 10# медицинские офтальмологические щипцы были использованы для тщательного отделения пуповины от пупочных кровеносных сосудов и эпителия шнура. Оставшаяся ткань разрезали на фрагменты 1–2 мм16. Кусочки ткани были уложены в кульце 10 см и помещали в инкубатор Co₂ 37 ° C в течение 30 минут. После этого 10 мл полной культуральной среды для музенхимальных стволовых клеток для пуповины человека были тщательно добавлены в блюдо, которое затем возвращали в инкубатор для культуры. Первичные мезенхимальные стволовые клетки могут наблюдаться, мигрирующие примерно через 7 дней, и когда они занимали 80–90% культурного блюда, клеточного прохода или криоконсервации.
Идентификация проточной цитометрии поверхностных маркеров мезонхимальных стволовых клеток пуповины
UC-MSC третьего поколения с хорошим ростом были отобраны и культивированы до 90–99% слияния. Клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, и супернатант отбрасывали, регулируя концентрацию клеток до 5 × 106/мл. Семь трубок EP были пронумерованы, с антителами CD90-FITC, CD44-PE, CD105-PERCP-CY5.5 и CD73-APC, добавленными в трубки от 1 до 4 соответственно. Трубка 5 служила пустым контролем. В трубе 6 содержалась смесь контрольных изотипов положительных антител (MIGG1-FITC, MIGG1-PERCP-CY5.5, MIGG1-APC) и контроль изотипа отрицательных антител (MIGG1-PE, MIGG2A-PE). Трубку 7 была заполнена смесью положительных антител (CD90-FITC, CD105-PERCP-CY5.5, CD73-APC) и отрицательные антитела (CD34-PE, CD11B-PE, CD19-PE, CD45-PE, HLA-DR-PE). Проточный цитометр использовался, и программное обеспечение Flow JO использовалось для анализа фенотипа клеток.
Индукция клеток и оценка дифференцировки
UC-MSC в фазе логарифмического роста собирали и высевали в культурные блюда диаметра 6 см в клеточных плотностях 2,0 × 104 клеток/см², 2,0 × 104 клеток/см/2,0 × 105 клеток/см/см. Культуры поддерживались в среде 37 ° C, 5% Co₂, пока они не достигли 80–90% слияния. Первоначальная культуральная среда отбрасывали, и добавляли индукционную среду дифференцировки для адипогенных, остеогенных и хондрогенных линий. Среда изменялась каждые 2–3 дня, и через 21 день индукционный статус наблюдался под микроскопом. Раствор окрашивания маслом красного цвета, раствор красно -окрашивания ализарина и раствор окрашивания синим цветом алцианов добавляли в адипогенную, остеогенную и хондрогенную индукционную среду, соответственно, для окрашивания. Изображения были получены под микроскопом для оценки индукции.
Экспериментальные животные
Женские крысы Sprague-Dawley (SD) класса SPF (предоставленные лабораторией Jinan Pengyue Flaining Co., Ltd., лицензия №: SCXK (LU) 20190003), в возрасте от 7 до 9 недель беременности, весом 150–200 г, содержались в отдельных клетках. Крыс размещали в контролируемых условиях, включая комнатную температуру (23–25 ° C), влажность 40–60%, цикл света/темноты 14 часов/10 часов, с доступом ad libitum к пище и воде. Они прошли 1–2 недели акклиматизации, в течение которой вагинальная цитология проверялась два раза в день, чтобы контролировать частоту и регулярность эстрального цикла. В общей сложности 30 крыс с последовательными эстральными циклами были отобраны для исследования. Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с руководством NIH для ухода и использования лабораторных животных. Работа была зарегистрирована в соответствии с руководящими принципами прибытия 2.0. UC-MSC и все исследования животных были одобрены Комитетом по этике Янтай Юхуандинг (№ 2024-554). Все методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами прибытия 2.0 и руководящими принципами Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) для эвтаназии животных (2020). Все последующие процедуры соответствовали институциональным руководствам и протоколу исследования, утвержденным Институциональным контрольным советом.
Экспериментальные крысы были случайным образом разделены на три группы: нормальная группа (не= 10), модельная группа (смоделирована с помощью механического повреждения, не= 10) и группа UC-MSCS (вводя UC-MSC в дозе 2 × 107/200 мкл, не= 10, подвешенные в 1 мл стерильных PBS впрыскивали в полость матки.) Случайные числа были получены с использованием функции Standard = Rand () в Microsoft Excel. Через неделю после создания модели внутриутробной адгезии UC-MSC вводили в полость матки посредством внутриматочной инфузии. Минимизируют потенциальных факторов, таких как порядок измерений и обработок. От четырех до пяти эстральных циклов после лечения крысы были убиты изофлурановой асфиксией, образцы матки собирали при анестезии для оценки условий эндометрия. Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E), окрашивание Массона и иммуногистохимическое окрашивание CK для наблюдения за изменениями толщины эндометрия и морфологии.
Создание модели внутриутробной адгезии (IUA)
Отшелушивающие вагинальные клетки от крыс собирали ежедневно в 7–8 часов утра и 3–4 вечера для мониторинга цикла. Женские крысы SD в эстральном эструзировании анестезировали вдыханием изофлураном. Был изготовлен разрез длиной около 2 см и 2 см над лобковым симфизом, и для выполнения комплексного соскоба полости матки была использована офтальмологическая кюрета. Сскабливание была остановлена, когда в организме матки наблюдалось значительное заторы, а стенка матки появилась грубой, с последующей соленой промывкой полости матки. В течение первых трех дней после операции пенициллин вводили через внутримышечную инъекцию в дозе 200 000 МЕ в день. Сбор тканей был строго ограничен фазой эструса для стандартизации образцов ткани гормонального статуса, которые были собраны во время фазы эстральной эстральной после операции по поводу окрашивания H & E, окрашивания Массона и иммуногистохимического окрашивания CK.
Измерение гистологических показателей (с использованием программного обеспечения обработки изображений ImageJ)
(1) Измерение толщины эндометрия: фотографии каждого окрашенного в H & E были сделаны при низком увеличении мощности с использованием оптического микроскопа. Четыре точки под прямым углом были выбраны в каждом разделе для измерения толщины эндометрия, и среднее значение было рассчитано как толщина эндометрия.
(2) Подсчет номер железы: количество желез в каждой окрашенной H & E -окрашенной секции было подсчитано и регистрировано как количество эндометриальных желез в матке крысы.
(3) Расчет области области фиброза фиброза эндометрия: для каждого окрашенного в Массоне было отобрано четыре случайных мощных полей, и было рассчитано соотношение фиброзной площади в строме эндометрия к общей площади эндометриальной стромы и желез. Среднее значение этих соотношений было зарегистрировано как соотношение области фиброза эндометрия.
(4) Измерение средней оптической плотности эндометриального окрашивания CK: фотографии каждого окрашенного CK -окрашенного участка были сделаны при низком увеличении мощности с использованием оптического микроскопа. Совокупное значение оптической плотности и общее количество белка каждого раздела были рассчитаны для получения среднего значения оптической плотности.
Ультразвуковые показатели измерения
Все крысы в нормальных, модельных и UC-MSCS-группах прошли измерение толщины эндометрия, используя небольшую ультразвуковую машину животных (Vinno Vinno6lab, Suzhou, China) перед рассечением для каждой группы. Морфология эндометрия и непрерывность полости матки также наблюдались во время этой оценки.
Показатели оценки
Перед рассечением у всех крыс в группах нормальных, моделей и UC-MSCS была измерена толщина эндометрия с использованием небольшого ультразвукового машины животных (Vinno Vinno6lab, 18 МГц, Сучжоу, Китай), чтобы наблюдать морфологию и преемственность эндометрия. После рассечения ткани матки собирали для фенотипического анализа. Окрашивание H & E использовалось для оценки количества эндометриальных желез, окрашивание Массона использовалось для оценки степени фиброза эндометрия, а иммуногистохимическое окрашивание CK проводилось для обозначения уровней экспрессии кератина.
Статистический анализ
Тест нормальности проводился на данные о измерении, и для анализа использовалась односторонняя ANOVA. Парные сравнения проводились с использованием теста LSD-T. Для данных, не соответствующих нормальному распределению, результаты были выражены как M (Q1 и Q3), а для анализа использовался U-тест Манна-Уитни, причем тест Данна был применен для парных сравнений. Уровень значимости П<0,05 считалось статистически значимым. Корреляция и анализ различий проводились с использованием линейного регрессионного анализа.
#Изучение #применения #значения #ультразвука #исследованиях #на #животных #терапии #стволовыми #клетками #для #внутриутробных #адгезий
По теме
