В недавнем отчете в журнале Туристическая медицина и инфекционные заболеванияисследователи представили компактный набор для быстрого обнаружения, который тестирует вирус оспы обезьян, используя комбинацию технологии рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) и кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR).
Фон
Вспышка оспы обезьян широко распространилась за пределы эндемичных стран Западной и Центральной Африки в 2022 году, и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила ее чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение. Возбудителем оспы обезьян является вирус оспы обезьян, относящийся к Ортопоксвирус род.
В настоящее время для выявления оспы обезьян используется тест полимеразной цепной реакции (ПЦР), который амплифицирует Ортопоксвирус или специфической дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вируса оспы обезьян. Однако ПЦР — утомительный процесс, требующий термоциклера, обученного персонала и лаборатории.
Раннее выявление и сдерживание инфицированных лиц крайне важно для борьбы со вспышкой заболевания. Иммуноанализы, такие как тест-полоски с латеральным потоком, проще и быстрее, чем ПЦР, но имеют более высокую перекрестную реактивность в отношении ортопоксвирусов, что затрудняет точное выявление оспы обезьян. Таким образом, технология, которая быстро выявляет оспу обезьян и дает точные и надежные результаты, имеет важное значение.
Механизм обнаружения
В настоящем исследовании исследователи разработали набор для быстрого обнаружения или карманную лабораторию для тестирования на вирус обезьяньей оспы. Набор для обнаружения использует принципы технологии RPA и CRISPR для повышения специфичности и чувствительности анализа. RPA амплифицирует целевые гены вируса оспы обезьян, которые сканируются направляющей рибонуклеиновой кислотой (РНК) CRISPR и ферментом CRISPR-ассоциированного белка 12a (Cas12a).
Опосредованное CRISPR/Cas12sa расщепление последовательности происходит только при обнаружении целевых ампликонов оспы обезьян, что исключает возможность неспецифических сигналов. Расщепление приводит к флуоресценции, что указывает на положительные образцы оспы обезьян.
Карманная лаборатория
Комплект весил 500 г, а корпус был водостойким и достаточно компактным, чтобы поместиться в кармане. Компоненты состояли из двух трехмерных печатных нагревательных блоков — блока A, который нагревает образцы до 80 ° C для лизиса вирусной оболочки, и блока B, который нагревает образцы до 40 ° C для амплификации ДНК.
В набор входили пробирки с лиофилизированными ферментами, защищенными трегалозой, и пробирки с раствором хлорида натрия и ацетата магния. В набор также входили буфер для регидратации, содержащий праймеры и флуоресцентный репортер, и ультрафиолетовый фонарик (УФ) для обнаружения флуоресценции.
Процесс тестирования включает добавление образца в пробирку для отбора проб и использование нагревательного блока А для лизиса оболочки вируса. Нагретый образец добавляют в пробирку с лиофилизированными ферментами, к которой добавляют регидратационный буфер. Затем нагревательный блок B используется для амплификации целевой области. Наконец, УФ-фонарик используется для обнаружения флуоресценции.
Во время пробного теста исследователи использовали образцы псевдотипированного вируса оспы обезьян, общее время, затраченное на это, составило 25 минут, а образцы с вирусными частицами до десяти были обнаружены с точностью.
Выводы
Подводя итог, исследователи представили новый набор для быстрого обнаружения, который был компактным и мог использоваться для обнаружения вируса оспы обезьян без использования сложных инструментов, обученных технических специалистов или лабораторной установки.
Набор для обнаружения использует принципы RPA и CRISPR для амплификации областей-мишеней ДНК оспы обезьян и расщепления ее с использованием комплекса CRISPR/Cas12a с флуоресцентным репортером, сигнализирующим об обнаружении ДНК вируса оспы обезьян.
Испытания псевдотипированного вируса показали успешное и быстрое обнаружение вируса оспы обезьян, что свидетельствует о потенциальном использовании набора для быстрого тестирования путешественников и в районах, где отсутствует соответствующая медицинская инфраструктура и обученный персонал.
