Аберрантное накопление РНК-связывающего белка TDP-43 в цитоплазме и его истощение из ядра являются патологическими признаками нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая разновидности лобно-височной долевой дегенерации (FTLD-TDP), бокового амиотрофического склероза (БАС) и болезни Альцгеймера (АД-). ТДП). Потеря TDP-43 из ядра ухудшает его способность подавлять включение загадочного экзона (CE) во время сплайсинга РНК. [1]. Следовательно, CE аномально включаются в критические транскрипты, такие как STMN2 и UNC13A. [2,3,4,5,6,7,8,9]которые могут производить укороченные или дестабилизированные РНК и приводить к потере их функции. Недавно мы и другие продемонстрировали, что некоторые транскрипты с CE в рамке продуцируют стабильные CE-содержащие новые белки, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости (СМЖ) у пациентов с FTLD-TDP или БАС. [10, 11]. Одним из ярких примеров является загадочный белок, полученный из гена белка 2, подобного фактору роста гепатомы (HDGFL2-CE), гистонсвязывающего белка, экспрессируемого по всему мозгу. Соответственно, HDGFL2-CE СМЖ потенциально может служить чувствительным биомаркером патологии TDP-43, освещая вклад патологического TDP-43 в клиническую вариабельность протеинопатий TDP-43. [11]. Но проверка того, является ли HDGFL2-CE СМЖ показателем патологии TDP-43, затруднена из-за отсутствия надежных методов измерения патологического TDP-43 в биожидкостях. Чтобы определить, можно ли использовать содержание HDGFL2-CE в качестве индикатора наличия патологии TDP-43, мы исследовали, экспрессируется ли HDGFL2-CE преимущественно в пораженных нейроанатомических областях с протеинопатией TDP-43 в когорте хорошо охарактеризованных посмертных пациентов. тканях от случаев FTLD-TDP и AD-TDP, а также связано ли обилие HDGFL2-CE с патологическим бременем TDP-43.
На основе предсказанной структуры белка HDGFL2-CE (рис. S1A) мы создали ранее описанное кроличье поликлональное антитело HDGFL2-CE (Mayo-LP). [10] который специфически обнаруживает белки HDGFL2-CE, но не белки HDGFL2 дикого типа (HDGFL2-WT) в лизатах из индуцированных TDP-43 плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) (рис. S1B). Используя коммерческое C-концевое антитело HDGFL2-WT в качестве захватывающего антитела и наше антитело Mayo-LP HDGFL2-CE в качестве детектирующего антитела, мы затем разработали иммуноанализ Meso Scale Discovery (MSD), который дозозависимо выявляет эндогенный белок HDGFL2-CE. в 500–8000 нг общего белкового лизата из TDP-43-истощенных нейронов, происходящих из ИПСК [10]. С тех пор мы дополнительно оптимизировали анализ путем биотинилирования захватывающего антитела, использования планшетов со стрептавидином MSD и тестирования различных разбавителей (рис. S1C-E). При использовании MSD Diluent 35 наш модифицированный анализ выявил HDGFL2-CE, но не HDGFL2-WT, в 16 нг общего белка в лизатах клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих эти белки (рис. S1D). Чтобы определить, является ли наш анализ достаточно чувствительным для обнаружения эндогенного HDGFL2-CE, мы использовали лизаты контрольных и иПСК, обедненных TDP-43. По сравнению с Diluent 35, Diluent 100 обеспечивал лучшее соотношение сигнал/шум при обнаружении эндогенного HDGFL2-CE всего в 125 нг общего белка из лизатов iPSC, обедненных TDP-43 (рис. S1E).
Затем мы проверили, может ли наш оптимизированный анализ обнаружить HDGFL2-CE в областях мозга FTLD-TDP (миндалина и лобная кора) и AD-TDP (миндалевидное тело), характеризующихся патологией TDP-43. [7]. По сравнению с когнитивно нормальным контролем (контролем), HDGFL2-CE был значительно увеличен в миндалевидном теле случаев FTLD-TDP и AD-TDP в нескорректированном анализе и с поправкой на возраст на момент смерти и пол (рис. 1A, таблица S1). Напротив, HDGFL2-CE лобной коры был значительно увеличен только в случаях FTLD-TDP по сравнению с контролем (рис. 1B, таблица S1). При сравнении случаев AD без патологии TDP-43 (AD без TDP) со случаями AD-TDP, HDGFL2-CE был значительно повышен в миндалевидном теле, но не в лобной коре, при AD-TDP (рис. 1A, таблица S1) – ожидаемый результат, учитывая малочисленность патологии TDP-43 в лобной коре в случаях AD-TDP.
рисунок 1
Белки HDGFL2-CE увеличиваются в областях мозга с патологией TDP-43 при FTLD-TDP и AD-TDP и отличают эти протеинопатии TDP-43 от контрольных групп без TDP-43. Количественное определение белков HDGFL2-CE в иммуноанализе в миндалевидном теле (A) и лобной коре (B) когнитивно нормального контроля (Ctrl, n = 27, n = 26 миндалины и n = 25 лобной коры), FTLD-TDP (n = 67) , AD-TDP (n = 70) и AD без TDP (n = 27). Данные представлены в виде среднего ± sem * P < 0,05 и **** P < 0,0001, нс: незначительно. (C, D) Область под кривыми рабочих характеристик приемника (AUC), показывающая дискриминационную способность HDGFL2-CE в миндалевидном теле или лобной коре, чтобы отличать FTLD-TDP от Ctrl (розовый), AD-TDP от Ctrl (золотой) и AD-TDP от AD без TDP (черный). Показаны значения AUC. (E – G) Диаграммы рассеяния содержания белка HDGFL2-CE и РНК с содержанием pTDP-43 в миндалевидном теле (E) и лобной коре (F) пациентов с FTLD-TDP, а также в миндалевидном теле пациентов с AD-TDP (G) ). Показаны коэффициенты регрессии (β) и значения P из линейного регрессионного анализа pTDP-43 с белком HDGFL2-CE и РНК с поправкой на возраст и пол.
Наличие HDGFL2-CE дифференцировало людей с патологией TDP-43 и без нее в миндалевидном теле: HDGFL2-CE различался между контрольной группой и людьми с патологией TDP-43 с площадью под кривой рабочей характеристики приемника (AUC) 0,85 и 0,92 для AD -TDP и FTLD-TDP соответственно, что указывает на хорошую или отличную дискриминационную способность (рис. 1C). При оценке того, отличает ли миндалевидный белок HDGFL2-CE AD no TDP от AD-TDP, мы обнаружили умеренную дискриминационную способность (AUC 0,68, рис. 1C). В лобной коре HDGFL2-CE дифференцировал контрольную группу и FTLD-TDP с AUC 0,82, что указывает на хорошую дискриминационную способность (рис. 1D).
Наконец, нагрузка фосфорилированного TDP-43 (pTDP-43) в миндалевидном теле и лобной коре значительно связана с белком HDGFL2-CE и содержанием РНК HDGFL2-CE в FTLD-TDP как в нескорректированном анализе, так и в анализе с поправкой на возраст на момент смерти, пол, и число целостности РНК (RIN), последнее для анализа только РНК HDGFL2-CE (рис. 1E, F, таблица S2). В миндалевидном теле случаев AD-TDP нагрузка pTDP-43 также связана с белком и РНК HDGFL2-CE в нескорректированных и скорректированных анализах (рис. 1G, таблица S2). Однако расчетные коэффициенты β оказались выше для белка HDGFL2-CE, чем для РНК HDGFL2-CE, что указывает на то, что белок HDGFL2-CE служит более точным индикатором дисфункции TDP-43.
Сохранение CE в мРНК из-за дисфункции TDP-43 хорошо документировано при FTLD-TDP, ALS и AD-TDP. [2,3,4,5,6,7,8]но открытие того, что некоторые CE внутри рамки генерируют стабильные загадочные белки, является новым. [8, 10, 11]. Здесь мы исследовали недавно идентифицированный белок HDGFL2-CE. Разработав чувствительный и специфичный иммуноанализ для обнаружения белков HDGFL2-CE, мы обнаружили, что HDGFL2-CE значительно увеличивается в областях мозга с патологией TDP-43 в FTLD-TDP и AD-TDP, ассоциируется с бременем pTDP-43 и может различать лиц с патологией TDP-43 от лиц без нее. В соответствии с нашими выводами, Irwin et al. использовали свое антитело HDGFL2-CE для иммунофлуоресцентного окрашивания тканей моторной коры и гиппокампа пациентов с БАС-ЛВД, демонстрируя, что белки HDGFL2-CE накапливаются в клетках, демонстрирующих патологию pTDP-43. [11]. Они также обнаружили, что по сравнению с контролем уровень HDGFL2-CE в СМЖ был статистически значимо выше у лиц с вероятной патологией TDP-43, а именно у носителей предсимптомной или симптоматической экспансии повторов C9orf72 и пациентов со спорадическим БАС. [11].
В совокупности эти результаты показывают, что присутствие HDGFL2-CE в мозге является чувствительным индикатором патологии TDP-43 при нейродегенеративных заболеваниях. Эти результаты позволяют CSF HDGFL2-CE служить суррогатным маркером патологии и дисфункции TDP-43, что, в свою очередь, будет способствовать выбору идеальных участников для клинических испытаний потенциальных терапевтических средств на основе TDP-43 и потенциально позволит разработать стратегии точной медицины для патологических подтипов. FTLD и AD.
2024-03-27 11:31:45
1711539750
#Криптические #белки #HDGFL2 #сообщают #наличии #патологии #TDP43 #при #нейродегенеративных #заболеваниях #Молекулярная #нейродегенерация
