Перампанел ослабляет окислительный стресс и пироптоз после субарахноидального кровоизлияния через путь SIRT3/FOXO3α.

Модели SAH

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Комитет по этике 904-й больницы НОАК клинической школы Уси Аньхойского медицинского университета одобрил все протоколы экспериментов. Взрослые самцы крыс Sprague-Dawley массой 280–320 г были получены из Медицинского колледжа Ханчжоу. Крысы были созданы для модели SAH посредством эндоваскулярной перфорации и в соответствии с протоколом нашего предыдущего исследования.²⁰. И 5% изофлурана (RWD, Гуандун, Китай) в N₂О/О₂ смесь (1:1) вводили анестезированным крысам с последующим введением 2,5% изофлурана с N₂О/О₂ (1:1) маска для лица из смеси для поддержания анестезии. Ложная группа была создана с использованием той же процедуры, без эндоваскулярной пункции.

Экспериментальный дизайн и группы животных

Экспериментальная дизайн

Эксперимент 1 Для проверки нейропротекторного эффекта перампанела 48 крыс (68 крыс были подвергнуты хирургическому вмешательству, из них 20 крыс исключены из-за гибели или степени SAH ≤ 7) были случайным образом разделены на 3 группы: группа имитации, группа SAH и группа SAH + Per, с По 16 крыс в каждой группе (как показано на рис. 1 эксперимент 1). По 8 крыс в каждой группе использовали для оценки неврологических показателей (модифицированная оценка Гарсиа и тест баланса луча), а у 6 крыс измеряли содержание воды в отрубях (BWC). Кроме того, в каждой группе было по 4 крысы для обнаружения окрашивания FJB и 6 крыс для вестерн-блоттинга (WB) изменений SIRT3 и FOXO3α. Кроме того, 6 крыс (совместно с анализом WB) использовали для ELISA для определения изменений воспалительных факторов IL-1β и IL-18. Испытания начались через 24 часа после успешного моделирования.

Эксперимент 2 Изучить, подавляет ли перампанел окислительный стресс и пироптоз, индуцированный NLRP3, путем запуска сигнального пути, опосредованного SIRT3. 64 крысы (86 крыс были подвергнуты хирургическому вмешательству, из них 22 крысы были исключены из-за гибели или степени SAH ≤ 7) были случайным образом разделены на четыре группы: имитация, SAH, SAH + Per (5 мг/кг) и SAH + Per + 3. -TYP (50 мг/кг), по 16 крыс в каждой группе (как показано на фиг. 1 эксперимент 2). Для оценки неврологического показателя использовали 8 крыс; для определения содержания воды в мозге использовали 6 крыс; для окрашивания FJB и иммунофлуоресцентного (IF) окрашивания использовали 4 крысы; для вестерн-блоттинга использовали 6. Кроме того, в каждой группе было по 6 крыс (совместно с анализом WB) для измерения уровней АФК, и 6 крыс (совместно с анализом WB) использовали для ELISA. Испытания начались через 24 часа после успешного моделирования.

Группы животных

Крысам в группе «Имитация» была проведена имитация операции с предварительной обработкой носителем. Крысам в группе SAH была проведена операция SAH с предварительной обработкой носителем. Крысы в ​​группе SAH + Per подвергались операции SAH с предварительной обработкой перампанелом/носителем. Крыс в группе SAH + Per + 3-TYP подвергали операции SAH с предварительной обработкой перампанелом/3-TYP.

Прием лекарств

Парампанел («Weicai», Китай) принимали внутрь в дозе 5 мг/кг за 2 ч до приступа САК. Перед моделированием внутрибрюшинно (в/б) вводили равные объемы 3-TYP (50 мг/кг) и носителя (1% этанола) в дозе каждые два дня, всего три дозы. Режимы дозирования перампанела и 3-TYP были основаны на предыдущих исследованиях.^9,21.

Оценка неврологического показателя

Неврологическую функцию крыс оценивали через 24 часа после САК на основе модифицированной системы оценки Гарсиа и теста баланса луча двумя наблюдателями, которые не знали об исследовании.²². Вкратце, модифицированный тест Гарсиа состоит из шести подтестов. Три субтеста: спонтанное движение, симметрия движений конечностей и вытягивание передних конечностей оцениваются от 0 до 3, тогда как остальные три теста (способность лазать, проприоцепция тела и реакция на прикосновение вибрисс) оцениваются по шкале от 1 до 3. в результате общая сумма баллов варьировалась от 3 до 18. Был проведен тест на балансировку балки для оценки способности крыс ходить в течение одной минуты по деревянной балке шириной 15 мм. Средний балл рассчитывали на основании способности ходить по трем последовательным баллам от 0 до 4. Чем выше балл, тем лучше неврологическая функция.

Уровень SAH

Тяжесть САК определялась отдельным наблюдателем, который не знал об эксперименте, используя степень САК, как сообщалось ранее.⁵. Короче говоря, в этой системе оценок баллы варьируются от 0 до 18 в зависимости от размера сгустка крови. Базальную часть крыс разделили на 6 срезов. Каждый срез оценивали следующим образом: отсутствие субарахноидального кровоизлияния регистрировали как 0, минимальное субарахноидальное кровоизлияние регистрировали как 1, умеренный объем крови с видимыми артериями регистрировали как 2 и сгустки, блокирующие все артерии, регистрировали как 3. Крысы с баллами ниже 8, указывающими на легкую САК, были исключены.

Содержание воды в мозгу

После анестезии и декапитации мозг крыс быстро удаляли через 24 часа после САК и сразу же определяли сырую массу. Затем мозг сушили в течение 24 часов при температуре 105℃ и получали сухую массу. Содержание воды в мозгу определяли следующим образом:[(wet weight − dry weight)/wet weight]× 100%.

Окраска гематоксилин-эозином (HE)

Окрашивание HE проводилось для наблюдения за патологической морфологией ткани головного мозга в соответствии с ранее описанным протоколом.²⁰. Крыс подвергали транскардиальной перфузии 500 мл 4% раствора для фиксации тканей (P1110, Solarbio, Китай) через 24 часа после САК. После более чем 24-часовой фиксации ткань головного мозга крысы обезвоживали и заливали в парафин для получения сплошного коронального среза толщиной 4–6 мкм. Депарафинированные срезы мозга крысы окрашивали стандартным окрашиванием HE, наблюдали под оптическим микроскопом и фотографировали.

Иммунофлуоресцентное (IF) окрашивание

Окрашивание IF проводили, как описано ранее.²². Ткани головного мозга крысы обезвоживались и заливались парафином для изготовления парафиновых срезов. Мозговая ткань, залитая парафином Секты. (толщина 4 ~ 6 мкм) нагревали с раствором восстановления антигена цитрата ЭДТА (P0086, Beyotime, Китай) в микроволновой печи в течение 30 минут. Затем срезы запечатывали при комнатной температуре на 30 минут с 5%-ной козьей сывороткой (SL038, SolarBioLife Science, Китай) и инкубировали в течение ночи при 4 ℃ со следующими первичными антителами: антителом против GSDMD (1:50, ab15515, Abcam) и антитело против NeuN (1:500, ab104224, Abcam). Впоследствии срезы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами. После промывки PBS ядра окрашивали в течение 15 мин 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) («Sigma Aldrich», США). Захват изображений проводился на флуоресцентном микроскопе (Leica, DMI8, Германия).

Окрашивание FJB

Степень повреждения нейронов в ипсилатеральной (правой) височной коре головного мозга оценивали с помощью окрашивания FJB, которое позволяет идентифицировать дегенерирующие нейроны. По предыдущему методу²²из ткани головного мозга крысы делали парафиновые срезы, как описано выше, и парафиновые срезы обрабатывали ксилолом в сочетании с градиентным этанолом. Приготовленный красящий раствор FJB («Sigma-Aldrich», США) инкубировали срезы при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем ядра окрашивали красителем DAPI в течение 10 мин и промывали чистой водой. После высушивания на воздухе срезы помещали в ксилол на 2 мин, а затем герметизировали нейтральной смолой. Наконец, изображения ипсилатеральной височной коры были собраны с помощью флуоресцентной микроскопии (Leica, DMI8, Германия). Статистику и анализ FJB(+) нейронов проводили вслепую.

Измерение уровней АФК

Производство АФК также измеряли с помощью набора ROS Assay (Nanjing Jiancheng, E004-1-1, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.⁷. Содержание АФК в тканях мозга оценивали как интенсивность флуоресценции/мг белка.

ИФА

Уровни провоспалительных факторов, включая IL-1β и IL-18, определяли с помощью набора для анализа IL-1β и набора для анализа IL-18. Уровень индекса окислительного повреждения головного мозга, включая малоновой диальдегид (МДА), анализировали с использованием набора для анализа МДА в соответствии с инструкциями производителя. Уровни антиоксидантных факторов, включая активность супероксиддисмутазы (СОД) и активности глутатионпероксидазы (GSHPx), измеряли с помощью коммерческих наборов (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Китай) соответственно в соответствии с инструкциями производителя. Ацетилирование FOXO3α (Ac-FOXO3α) измеряли с помощью набора для анализа Acetyl-FOXO3α (JCL005, Китай) для крыс.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее.²⁰. Сначала лизат RIPA («Beyotime», Китай) использовали для экстракции белка из коры головного мозга крыс, а затем определяли концентрацию белка между группами методом BCA («Beyotime», Китай). В каждую группу вводили по тридцать микрограммов общего белка и добавляли одинаковый объем 2X буфера для образцов Лэммли. Затем образцы кипятили (5 мин) для денатурации белка. Вареный белок переносили из геля на ПВДФ-мембрану (Millipore, США) после электрофореза в додецилсульфат-полиакриламидном геле натрия. Затем мембрану блокировали и инкубировали в течение ночи с правильно разведенным первичным антителом в блокирующем буфере при 4°C. Мембрану промывали TBST три раза (каждый раз по 5 минут), а затем инкубировали с рекомендованным разбавленным HRP-конъюгированным вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембрану трижды промывали моющим средством TBST по 5 мин каждый раз. Наконец, блоты визуализировали с помощью набора ECL (Beyotime, Китай) и количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, США). Первичные антитела включали анти-SIRT3 (1:1000, Ab246522, Abcam); анти-FOXO3α (1:1000, AF6020, Affinity); анти-CAT (1:2000, 66765-1-Ig, Proteintech); анти-MnSOD (1:10000, 66474-1-Ig, Proteintech); анти-NLRP3 (1:1000, DF7438, Affinity); анти-ASC (1:1000, DF6304, Affinity); антирасщепленная каспаза 1 (1:1000, AF4022, Affinity); анти-N-GSDMD (1:1000, A22523, ABклонал); и анти-β-актин (1:1000, AF7018, Affinity).

статистический анализ

Для статистического анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism (8.0, Сан-Диего, Калифорния, США). Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). После теста на нормальность данные между двумя группами сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента, тогда как различия между несколькими группами анализировались с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным критерием Тьюки. Значение AP менее 0,05 считалось указывающим на значительную разницу.

Заявление

Мы заявляем, что это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями ARRIVE (Исследования на животных: отчеты об экспериментах in vivo).