Лучший способ обнаружить нецелевые изменения генома в базовых редакторах.

Ученые и врачи смогут лучше оценить технологию точного редактирования генома, используя новый метод, обнародованный сегодня Детской исследовательской больницей Св. Иуды. Значительное количество времени и ресурсов, потраченных на совершенствование технологии редактирования генов CRISPR, сосредоточено на выявлении небольших нецелевых сайтов, которые представляют угрозу безопасности, что также технически сложно.

Исследователи из Сент-Джуда решили эту проблему, создав циркуляризацию для высокопроизводительного анализа эффектов нуклеазы в масштабе всего генома с помощью редакторов базы секвенирования (CHANGE-seq-BE), беспристрастный, чувствительный и ресурсоэффективный метод для обнаружения таких нецелевых изменений. Он превзошел традиционные подходы и уже использовался для поддержки клинических работ. Техника была опубликовано в Природная биотехнология.

В то время как традиционная технология редактирования генома использует CRISPR-Cas9 для вырезания небольшого сегмента ДНК из генома, ученые продолжают разрабатывать более точные версии, в том числе базовые редакторыкоторый может находить и заменять отдельные пары оснований ДНК.

«Мы разработали CHANGE-seq-BE, чтобы дать ученым возможность лучше понять базовые редакторы, важный класс точных редакторов генома CRISPR», — сказал соавтор Шэндар Цай, доктор философии, отделение гематологии Сент-Джуда. «Это простой и оптимизированный способ понять глобальную деятельность базовых редакторов, который позволяет исследователям выбирать узкоспециализированные и активные редакторы и целевые комбинации для исследований или терапии».

CHANGE-seq-BE уже применяется для поддержки клинических исследований. Опубликованная сегодня статья включает в себя тематическое исследование срочной заявки в Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для базового редактора, лечащего синдром CD40L-дефицитного X-связанного гиперIgM (X-HIGM). X-HIGM — это генетическое иммунное заболевание, которое можно исправить с помощью редактирования баз. CHANGE-seq-BE смог подтвердить 95,4% целевой специфичности использованного базового редактора без каких-либо значительных нецелевых действий, что предоставило ценные данные о безопасности, которые помогут ускорить лечение пациента.

«Это была действительно интересная заявка на поддержку срочного запроса к FDA о быстром лечении пациента», — сказал Цай. «Это пример того, как этот метод позволяет быстро понять, что эти редакторы делают в геноме, и помогает продвигать многообещающие активные и специфичные методы лечения».

Сочетание эффективности с непредвзятым подходом обеспечивает лучшие результаты.

Лаборатория Цая создала CHANGE-seq-BE, поскольку традиционным методам оценки безопасности редакторов баз приходилось выбирать между всесторонним охватом и эффективным использованием ресурсов. Некоторые методы, позволяющие всесторонне и беспристрастно выявить нецелевую активность редактирования базы, требуют секвенирования всего генома, что может быть непомерно дорогим и отнимать много времени.

Альтернативно, некоторые методы предварительно выбирают предполагаемые нецелевые изменения, чтобы выполнять меньшее секвенирование и экономить ресурсы, но эти предвзятые методы никогда не могут обнаружить неожиданные нецелевые изменения. Ученые из Сент-Джуда разработали CHANGE-seq-BE, чтобы воплотить в себе лучшее из обоих подходов: комплексное решение, которое также будет эффективно использовать ресурсы.

Для этого CHANGE-seq-BE начинается с целого генома, но вместо того, чтобы немедленно секвенировать его, ученые разделяют геном на крошечные кружки ДНК. Затем они берут эти круги и подвергают их тестированию базового редактора.

После этого они обрабатывают ДНК специальным ферментом, который определяет, произошло ли редактирование оснований, открывая те — и только те — круги ДНК с признаками редактирования оснований в линейные цепи. Затем линейные цепи ДНК выборочно секвенируются, что требует гораздо меньше ресурсов, чем конкурирующие методы. Они оптимизировали его для обоих основных типов редакторов оснований (редакторов оснований аденина и цитозина).

После разработки метода ученые хотели знать, действительно ли он является более всеобъемлющим и ресурсоэффективным, чем традиционные подходы, поэтому они протестировали их лицом к лицу.

«Когда мы напрямую сравнили его с другими методами, CHANGE-seq-BE обнаружил почти все сайты, выбранные этими методами, а также многие, которые он смог обнаружить исключительно с помощью этого метода», — сказал Цай. «Мы показали, что этот беспристрастный подход был более чувствительным при использовании только около 5% считываний секвенирования».

Учитывая чувствительность этого метода, простоту использования и эффективное использование ресурсов, другие уже начали его применять. В исследовании описаны полные экспериментальные протоколы и программное обеспечение для включения CHANGE-seq-BE, что позволяет его принять. Например, в дополнение к клиническому применению, о котором сообщается в статье, клинические испытания в Сент-Джуде и за его пределами включили эту технику в свое планирование, используя ее в качестве инструмента оценки безопасности и эффективности.

CHANGE-seq-BE также недавно был использован для характеристики первого индивидуального метода редактирования генома in vivo. Лаборатории фундаментальных исследований, изучающие редактирование базы, также начали использовать его для проверки на предмет нецелевых результатов на ранних этапах своего процесса, что позволяет лучше определять наиболее перспективные подходы, чем существующие экраны. Эти первые пользователи демонстрируют привлекательность этой методики как для исследователей, так и для врачей, а также ее обещание продвинуть вперед будущее редактирования баз.

«Мы позволили тем, кто разрабатывает эти методы лечения, быстро понять и найти базовые редакторы с наивысшей потенциальной активностью и специфичностью», — сказал Цай. «Мы надеемся, что такие методы, как CHANGE-seq-BE, откроют двери для разработки большего количества методов редактирования генома, которые смогут охватить пациентов, которые в них нуждаются».