Мыши
Иммунодефицитный NOD.SCID-IL2Rɣ−/− Мыши (NSG) были получены от Charles River Laboratories (Барселона, Испания) и содержались в Центре ухода за животными Немецкого научно-исследовательского института Trias i Pujol. Мышей NSG содержали в особых условиях, свободных от патогенов, в цикле 12 часов темноты/12 часов света с едой и водой без ограничений. Мышей анестезировали с помощью изофлурана (Forane, Abbvie pharmaceutics, Мадрид, Испания) и усыпляли путем смещения шейных позвонков. Все исследования на животных были одобрены институциональным комитетом по этике животных.
Изоляция клеток
Образцы UCB были получены из Биобанка исследований крови и тканей (Барселона, Испания). Все образцы были получены между 20 и 72 часами после доставки. Для выделения CD34+ клеток, UCB инкубировали с RosetteSep (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада) в течение 20 мин перед очисткой в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque (GE Healthcare, Уппсала, Швеция) и центрифугированием при 700г в течение 30 мин. CD34+ клетки были отобраны из фракции мононуклеарных клеток с использованием CD34 пуповинной крови человека EasySep.+ набор для селекции II (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада). Вкратце, мононуклеарные клетки инкубировали с антителами против CD34 человека и антителами, блокирующими FcR, в течение 10 мин. Затем к клеточной суспензии добавляли микрогранулы декстрана и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Иммуномагнитную селекцию проводили с использованием магнитов EasySep (STEMCELL Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Затем чистоту, жизнеспособность и количество клеток оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием антител против CD34-PE человека (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США), антител против CD45-FITC человека (BD Biosciences), 7-амино-актиномицина-D. (7-AAD, BD Biosciences) и Microbeads Perfect Count (Cytognos, Саламанка, Испания). Использовались только образцы с чистотой клеток выше 75% и жизнеспособностью выше 90%.
Культура клеток
CD34+ стволовые клетки культивировали при плотности 1 × 105 CD34+/мл с полной средой (CM) RPMI-1640 (Biowest, Nuaille, France), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), пенициллин (100 ЕД/мл, Normon SA, Мадрид, Испания) , стрептомицин (100 мкг/мл, Reig Jofre, Sant Joan Despí, Испания), глутамин (2 ммоль/мл, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), пируват натрия (1 ммоль/л, Gibco) и бета- -меркаптоэтанол (1 ммоль/л, Sigma-Aldrich). Кроме того, в CM добавляли следующие факторы роста человека: фактор стволовых клеток (100 нг/мл), лиганд тирозинкиназы 3, связанный с FMS (100 нг/мл), IL-6 (50 нг/мл) и тромбопоэтин (40 нг/мл). /мл; Preprotech, Лондон, Великобритания). В зависимости от состояния группы клетки культивировали с бетаметазоном (100 нМ, Sigma-Aldrich), пропионатом флутиказона (100 нМ, Fluticasone, Selleckchem, Хьюстон, Техас, США) или фосфатно-солевым буфером (PBS). Концентрация глюкокортикоидов была выбрана на основе наших предыдущих результатов (Perna-Barrull et al. 2019). Клетки инкубировали в течение 20 ч при 37 ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO.2. Перед трансплантацией жизнеспособность и CD34+ чистоту оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием антител против CD34-PE человека (BD Biosciences), антител против CD45-FITC человека (BD Biosciences) и 7-AAD (BD Biosciences). Кроме того, количество клеток определяли с использованием микрогранул Perfect Count (Cytognos, Саламанка, Испания).
Предтрансплантационный фенотип CD34+ Клетки
Фенотип CD34+ HSC, подвергшиеся воздействию бетаметазона или флутиказона через 20 ч культивирования, определяли с помощью проточной цитометрии. С этой целью 20 000 CD34+ клетки каждой группы (контроль, бетаметазон и флутиказон) окрашивали античеловеческими CD34 PE (BD Biosciences), HLA-ABC FITC (Immunotools), CD45 PercP (BD Biosciences), CD40 APC (Immunotools), CD54 PE-Cy7. , CXCR4 APC-Cy7 и HLA-DR V500 (BD Biosciences), а средние значения интенсивности флуоресценции получали с использованием цитометра FACS Canto II (BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).
CD34+ Трансплантация клеток пуповинной крови
Мышей пересаживали в возрасте 8–10 недель. Перед трансплантацией мышей подвергали сублетальному облучению всего тела в дозе 1 или 2 Гр с использованием источника цезия (Scherin, IBL 437 C). Стандартное облучение при NSG составляет от 2 до 4 Гр (McDermott et al. 2010). Мы считали 2 Гр оптимальным облучением и 1 Гр субоптимальным облучением. После облучения мышей рандомизировали в лечебные группы. Через шесть часов после облучения трансплантацию мышей проводили путем пересадки 2–5 × 105 CD34+ клетки, полученные после 20-часового воздействия на культуру клеток бетаметазоном (100 нМ, Sigma-Aldrich) или флутиказоном (100 нМ, Selleckchem). В качестве контроля та же доза не глюкокортикоидов подвергала воздействию CD34.+ использовали клетки из той же UCB. Клетки вводили внутривенно в хвостовую вену. В каждой экспериментальной группе трансплантировали по 3–5 мышей.
Проточной цитометрии
Для оценки изменений, вызванных бетаметазоном в субпопуляциях лейкоцитов трансплантированных мышей, периферическую кровь получали каждые 1-2 недели в течение 20 недель. Кроме того, в конце исследования забирали костный мозг и селезенку, а одноклеточные суспензии получали механическим разрушением. Клетки окрашивали антителами против CD3 BV650 человека, CD4 AF488, CD8a AF700, CD1c PE, CD14 BV711, CD16 BV605, CD20 AF700, CD25 BV421, CD45 BV510, CD56 APC, CD123 PE-Cy7, CD127 PerCP Cy5.5, HLA- DR BV785 (все от Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США), CD11c PE-efluor610 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США), TCR gd PE-Cy7 (BD Biosciences), антимышиный CD45 AF700 (eBioscience) и Alexa Fluor 750 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) на жизнеспособность. Клетки периферической крови окрашивали непосредственно, а перед получением использовали раствор для лизиса/фиксации эритроцитов (Biolegend). Приобретение было выполнено с использованием цитометра LSR Fortessa (BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc). Проценты химеризма рассчитывали как количество лейкоцитов человека (HuCD45+) по отношению к общему числу лейкоцитов (HuCD45+ и muCD45+). Подмножества лейкоцитов человека определяли, как указано в таблице 1.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Prism 9.3 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Для сравнения между группами использовали критерий Фридмана с апостериорным критерием Данна или анализ смешанных эффектов с поправкой Гейссера-Гринхауза и апостериорный критерий множественного сравнения Тьюки. Для сравнения между обработками в последующих экспериментах использовали критерий Уилкоксона для площади под кривой (AUC), а различия между неделями в последующем эксперименте для каждой группы оценивали с помощью критерия Тьюки (три обработки) или критерия Уилкоксона. (две обработки) тест множественных сравнений. Для парных данных использовали непараметрический критерий Уилкоксона.
